Modulazione a livello epigenetico del programma EMT attivato dal TGF-β1 in cellule MCF-10A

La transizione epitelio mesenchima è un processo estremamente complesso attraverso il quale una cellula epiteliale altamente polarizzata acquisisce caratteristiche morfologiche e funzionali assimilabili a quelle presenti in cellule di natura mesenchimale come i fibroblasti. Questo processo è stato evidenziato e caratterizzato in tre fondamentali situazioni: nello sviluppo embrionale, nella riparazione delle ferite, e a livello patologico, durante lo sviluppo tumorale e la fibrosi. Il principale induttore di EMT è il TGF-β1, una citochina estremamente importante nella regolazione della crescita cellulare, della migrazione, della apoptosi, e differenziazione. Una cellula epiteliale che completa il programma EMT perde la propria polarità, le giunzioni cellulari si dissolvono e si formano fibre di F-Actina necessarie alla contrazione citoscheletrica. Il marcatore per eccellenza per la EMT è la perdita di espressione della E-caderina. Il TGF-β1 si lega al complesso recettoriale e ne induce autofosforilazione. A sua volta il recettore fosforila le proteine Smad2/3, consentendo loro di legarsi a Smad4, traslocare nel nucleo ed attivare numerosi geni fra cui Snail, il repressore del gene che codifica per la E-Caderina. Lo scopo del progetto di ricerca riguarda lo studio della EMT e della regolazione trascrizionale di Snail a livello epigenetico in cellule non tumorigeniche di epitelio mammario umano MCF10A. Da esperimenti da me condotti si evidenzia che il TGF-β1 induce un aumento dei livelli dell’mRNA di Snail a 90 minuti dalla stimolazione e che la trascrizione del gene Snail è finemente regolata a livello epigenetico. Le proteine coinvolte sono risultate essere LSD1 e JMJD2A. Queste due demetilasi istoniche sono deputate alla rimozione dei gruppi metili sulle lisine dell’istone H3. In particolare LSD1 elimina i gruppi metile sulla lisina in posizione 4 sulla coda dell’istone H3, mentre JMJD2A agisce rimuovendo i gruppi metili sulla lisina in posizione 9. La presenza o meno di questi gruppi metile regola finemente la trascrizione genica. In letteratura è dimostrato che la rimozione della lisina in posizione 4 porta a repressione genica, mentre la rimozione del metile sulla lisina 9 porta ad attivazione genica. Ho dimostrato che queste proteine partecipano alla regolazione trascrizionale di Snail legandosi al complesso Smad2/3. LSD1 si lega a 30 minuti, per poi staccarsi dal complesso poco dopo, mentre JMJD2A vi si lega a 90 minuti. LSD1 ha un effetto repressorio su Snail mentre JMJD2A ne promuove la trascrizione. Infatti il silenziamento di LSD1 porta a una EMT più marcata mentre il silenziamento di JMJD2A non permette il verificarsi della EMT. Inoltre ho osservato che a 30 minuti dalla stimolazione con TGF-β1 viene rimossa la H3K4me2 mentre a 90 minuti viene rimossa la H3K9me3. Come detto in precedenza è stato dimostrato che la EMT è un processo ROS dipendente. I ROS sono stati trovati anche nel nucleo, dove possono causare un danno ossidativo transitorio al DNA. A circa 30 minuti dalla stimolazione con TGF-β1è possibile osservare un danno di questo tipo, causato proprio da LSD1. LSD1, durante la rimozione di gruppi metile produce H2O2, provocando una ossidazione del DNA che viene prontamente riparata. Il ruolo di questi ROS non è chiaro ma probabilmente fanno da segnale per il reclutamento di proteine della riparazione e repressorie. Alla luce di ciò posso concludere che sicuramente la EMT in tali cellule è un processo ROS dipendente poiché in presenza di NAC il TGF-β1 non segnala e la transizione non avviene. Inoltre, oltre ai ROS segnalatori sono presenti ROS nucleari prodotti da una proteina ad attività repressoria su Snail. Le due demetilasi hanno un ruolo centrale nel regolare la EMT. LSD1 tiene a freno durante le prime fasi la trascrizione precoce di Snail mentre JMJD2A, togliendo un segnale inibitorio, consente la EMT. Durante il terzo anno di dottorato mi sono occupato di un nuovo progetto di ricerca riguardante il metabolismo tumorale. In particolar modo ho studiato il ruolo della via dei pentoso fosfati nel mantenimento del bilancio redox in cellule di carcinoma prostatico PC3. Ho dimostrato che sotto stimoli pro-ossidanti come l'ipossia o il CM-PCa-AF (terreno condizionato di fibroblasti attivati dal terreno di cellule PC3), tali cellule, riescono a eliminare i ROS. Ho osservato che anche la linea silenziata per la G6PD è in grado di farlo. Rispetto alla linea normale, la linea cellulare silenziata attiva una forte risposta antiossidante guidata dalla traslocazione nucleare di Nrf2. Tale risposta antiossidante compensa la ridotta espressione della G6PD, consentendo alle cellule silenziate di eliminare i ROS.