OSTEOINDUZIONE DI CELLULE STAMINALI MESENCHIMALI DERIVATE DA TESSUTO ADIPOSO UMANO SU FILM DI POLY-(Ɛ-CAPROLATTONE)

Introduzione L’ingegneria tissutale dell’osso rappresenta uno dei campi più entusiasmanti e dinamici della ricerca scientifica biomedica. La possibilità di combinare cellule staminali e particolari substrati, (scaffold) con lo scopo di creare tessuti ingegnerizzati, ha promosso lo studio di numerosi biomateriali in grado di supportare la differenziazione di cellule osteoprogenitrici. Il tessuto adiposo umano rappresenta una fonte ottimale di cellule staminali mesenchimali. Infatti tale tessuto è ubiquamente presente nel corpo umano, è facilmente ottenibile attraverso un semplice intervento di liposuzione, e, a parità di peso, la resa di cellule staminali mesenchimali che possiamo ricavare risulta significativamente maggiore rispetto ad altri tessuti e con un grado di purezza superiore al 95% [1]. Le cellule staminali mesenchimali ricavate da tessuto adiposo (hAMSCs) sono state ampliamente studiate in termini di staminalità e capacità differenziativa osteogenica e, visto il loro potenziale, molti ricercatori hanno studiato il loro possibile utilizzo in combinazione con molteplici materiali, incluso ceramiche, leghe metalliche e polimeri per l’ingegneria tissutale dell’osso [2]. Scopo In questo studio, abbiamo valutato la capacità delle hAMSCs di differenziare verso il fenotipo osteogenico, su film di poly-(Ɛ-caprolattone), PCL, al fine di dimostrare il potenziale impiego di tale modello cellula-biomateriale per future applicazioni di rigenerazione ossea. Il polimero PCL è stato scelto poiché non tossico, biocompatibile, biodegradabile e con una lenta cinetica di degradazione; inoltre è stato largamente studiato per differenti applicazioni biomediche come sistema di rilascio, come dispositivo medico e per l’ingegneria tissutale [3]. Materiali e Metodi Le hAMSCs sono state isolate dal tessuto adiposo di un paziente, sottoposto ad un intervento di chirurgia generale, dopo firma di un consenso informato in accordo al protocollo approvato dal Comitato Etico Locale dell’AOUC di Firenze (Rif. N.31-13). Brevemente, il tessuto adiposo è stato frantumato e digerito in 3 mg/ml di collagenasi di tipo I a 37°C per 3 ore. In seguito a disgregazione meccanica e a ripetute centrifugazioni, le cellule primarie sono state coltivate in terreno di crescita (Ham’s F12 Coon’s modification medium, 10% FBS, 1 ng/ml bFGF e 1% di antibiotici). Il film di PCL è stato preparato mediante tecnica di allontanamento del solvente (solvent casting) dalla soluzione polimerica al 5% p/v e suddiviso in dischetti di diametro di 14 mm. Le hAMSCs sono state seminate su film di PCL alla concentrazione di 1 x 105 a pozzetto (MW24) e dopo una settimana, il terreno di crescita è stato sostituito da terreno di osteoinduzione (OM) costituito da Ham’s F12 Coon’s modification medium, 10% FBS, 10 nM desametasone, 0.2 mM sodio L-ascorbil-2-fosfato, 10 mM β-glicerofosfato, 1 µg/ml calceina e 1% antibiotici. Sono stati presi in considerazione 6 tempi sperimentali (T0, 7, 14, 21, 28, 35 giorni) per la quantificazione dell’attività dell’enzima fosfatasi alcalina (ALP) e dei depositi di calcio mineralizzati mediante dosaggi spettrofluorimetrici. Gli esperimenti sono stati condotti in quadruplicato ed ogni esperimento ripetuto tre volte. L’analisi statistica è stata effettuata mediante test T di Student. I risultati ottenuti sul biomateriale sono stati comparati con quelli ottenuti differenziando le hAMSCs su plastica da coltura polistirene (PS). I dati ottenuti su film di PCL, che non sono risultati significativamente inferiori rispetto a quelli ottenuti su PS, sono stati considerati positivi. Risultati Le hAMSCs differenziate su film di PCL hanno mostrato un significativo incremento nell’attività di ALP (marker precoce della differenziazione osteogenica) dopo 14 giorni di induzione, raggiungendo un massimo dopo 21 giorni di incubazione corrispondente a 41.53 µU/µg di DNA e ad un incremento di 7355% rispetto al tempo 0 non indotto. Questo aumento rimane costante a 28 giorni per poi diminuire dopo 35 giorni di induzione. La formazione di matrice extracellulare mineralizzata è stata valutata mediante quantificazione della produzione di noduli di calcio mineralizzati. I risultati hanno evidenziato un significativa produzione di depositi di calcio da parte delle hAMSCs a partire da 14 giorni di induzione, raggiungendo un valore massimo a 35 giorni, corrispondente a 111.53 ng/µg di DNA e ad un incremento di 13337% rispetto al tempo 0 non indotto. Entrambi i suddetti paramenti, valutati su film di PCL, non hanno dato valori significativamente differenti rispetto a quelli ottenuti inducendo le hAMSCs su PS, substrato di controllo, durante l’intero periodo di studio. Conclusioni Questo lavoro ha dimostrato che le hAMSCs sono in grado di differenziare verso il fenotipo osteogenico su film di PCL preparato mediante solvent casting, suggerendo e promuovendo la ricerca di nuove strategie in grado di aumentare e massimizzare la differenziazione cellulare sul substrato per la futura applicazione nell’ingegneria dei tessuti ossei.