MUSCOLO SCHELETRICO UMANO COME FONTE DI CELLULE SATELLITI PER LO STUDIO IN VITRO DEL PROCESSO DI RIGENERAZIONE MUSCOLARE

Introduzione Il muscolo scheletrico è costituito da numerose fibre multinucleate, le quali possiedono la capacità contrattile per generare il movimento. In tale tessuto risiede anche una popolazione di piccole cellule mononucleate staminali, chiamate cellule satelliti (CS), che rappresentano il 2-10% delle cellule muscolari totali (da 2x105 a 1x106 cellule/gr di muscolo) [1]. Le CS sono localizzate in una speciale nicchia situata tra il sarcolemma della miofibra e la lamina basale, e sono di fondamentale importanza per la crescita e la rigenerazione del muscolo scheletrico. Nel muscolo adulto sano, le CS sono quiescenti ma pronte per l’attivazione. Durante la rigenerazione muscolare, le CS rientrano in modo transiente nel ciclo cellulare per proliferare e, successivamente, per differenziarsi e auto-rigenerarsi [2]. Scopo Scopo di questo studio è stato quello di isolare le CS dal muscolo scheletrico umano e testare la loro capacità a differenziare in miofibre al fine di sviluppare un modello utile per gli studi di differenziazione muscolare e per lo screening di nuove molecole terapeutiche da impiegare nel trattamento delle malattie muscolari. Materiali e Metodi Le CS sono state isolate dal muscolo scheletrico di un paziente sottoposto a chirurgia plastica ricostruttiva, dopo firma di un consenso informato in accordo al protocollo approvato dal Comitato Etico Locale, AOUC di Firenze (Rif. N.14.017). Brevemente, il tessuto muscolare è stato frantumato e digerito in 3 mg/ml di collagenasi di tipo I a 37°C per 3 ore. In seguito a disgregazione meccanica e a ripetute centrifugazioni, le cellule primarie sono state coltivate in terreno di crescita (PromoCell cod. C-39360) ed è stata valutata, in immunocitochimica, la presenza del fattore trascrizionale PAX-7, principale marker delle CS. La differenziazione cellulare è stata effettuata incubando le cellule a confluenza con terreno di induzione (PromoCell cod.C-39366) per 10 giorni e valutando, in RealTime q-PCR ed immunocitochimica (ICC), i principali marker implicati nella mio differenziazione (Myogenin e Myosin Heavy Chain, MHC). Tutti gli esperimenti sono stati condotti utilizzando colture primarie ai passaggi 2-3. L’analisi statistica è stata effettuata mediante test T di Student. Risultati La caratterizzazione delle CS isolate dal muscolo scheletrico ha confermato la presenza del fattore trascrizionale nucleare PAX-7, coinvolto nella sopravvivenza, nel mantenimento e nell’auto-rinnovamento dei progenitori muscolari e scheletrici. La differenziazione miogenica ha evidenziato, già dopo 4 giorni di induzione, la presenza di caratteristiche cellule multinucleate allungate riconducibili a miotubuli. L’avvenuta miogenesi e l’effettiva maturazione in miofibre è stata confermata da un aumento significativo (*p<0.005) dell’espressione genica di Myogenin e MHC ed è stata dimostrata in ICC l’effettiva produzione della proteina MHC, essenziale per la contrazione del muscolo scheletrico e, pertanto, di primaria importanza per il movimento muscolare. Conclusioni Tale studio ha evidenziato che le CS isolate dal tessuto muscolare umano rappresentano un buon modello per studiare i meccanismi di differenziazione muscolare e per lo sviluppo e l’identificazione di nuovi approcci terapeutici nel trattamento delle patologie muscolari degenerative.