Quality by Design per l’ottimizzazione dell’analisi UHPLC di polifenoli selezionati nel Diospyros Kaki

Il Diospyros kaki possiede valori nutrizionali e nutraceutici elevati, a causa delle sue significative concentrazioni di metaboliti primari e secondari. Lo scopo di questo lavoro è stato lo sviluppo di un metodo UHPLC (Ultra High Performance Liquid Chromatography) per l'analisi di polifenoli selezionati, utilizzando per la loro rivelazione la spettrometria di massa a triplo quadrupolo. L'ottimizzazione del metodo è stata effettuata attraverso i principi del Quality by Design, basati sull’utilizzo di strumenti quali la valutazione dei rischi e le strategie multivariate. Durante la fase di scouting è stata scelta una colonna Acquity BEH C18 150 mm x 2.1 mm, con diametro delle particelle pari a 1.7 μm (Waters Corporation). Gli attributi critici di metodo (CMA) del cromatogramma, sono stati le risoluzioni critiche di alcuni composti isobari e il tempo di analisi. I parametri critici di metodo (CMP), selezionati con il diagramma di Ishikawa, sono stati: flusso, temperatura, composizione iniziale della fase mobile, percentuale di acido formico negli eluenti, tipo di eluente organico e gradiente. Gli effetti dei CMP sui CMA sono stati valutati con una strategia multivariata, utilizzando prima una fase di screening e quindi uno studio della superficie di risposta (Response Surface Methodology, RSM). Nella fase di screening lo spazio di conoscenza è stato investigato con una matrice di screening asimmetrica. L'analisi grafica degli effetti ha permesso di fissare il tipo di solvente organico (metanolo) ed il valore ottimale del flusso, nonché di selezionare nuovi domini sperimentali per gli altri CMP coinvolti. Nella fase di RSM i modelli sono stati calcolati tramite Disegno di Doehlert e sono stati rappresentati graficamente tramite i contour plots. Le zone dove le combinazioni dei valori dei CMP permettevano di ottenere i valori desiderati per tutti i CMA (valori di risoluzione ≥ 1, tempo di analisi ≤ 20 min), sono state ottenute tramite gli sweet spot plots. Lo spazio del disegno (MODR), identificato come la combinazione multidimensionale dei CMP che soddisfacevano i requisiti per i CMA con probabilità π ≥ 90%. Le condizioni finali scelte per l’analisi sono state: flusso, 0.3 mL min-1; temperatura, 55°C (52-60°C); composizione iniziale della fase mobile, 4% v/v (2-6% v/v); percentuale di acido formico negli eluenti, 0.050% v/v (0.005-0.650% v/v); tipo di eluente organico, metanolo; gradiente, 3.50% B min-1 (2.62-5.00% B min-1), con in parentesi l’intervallo relativo al MODR. La convalida del MODR e la verifica della robustezza del metodo sono state effettuate mediante mediante una matrice di Plackett-Burman. Dopo convalida, il metodo è stato applicato a campioni reali di frutti di due cultivar di Diospyros kaki (Rojo Brillante e Kaki Tipo), freschi e sottoposti a trattamento di deastringenza mediante etilene o CO2. Nei campioni analizzati sono stati quantificati 29 composti fenolici, 11 dei quali identificati in questo tipo di frutto per la prima volta. I due processi di trattamento hanno influenzato in modo diverso i profili fenolici dei frutti, con il trattamento a base di etilene che risulta più conservativo, fornendo concentrazioni più elevate di composti fenolici nel frutto commestibile. Questo risultato è chiaramente evidenziato anche da analisi delle componenti principali e da analisi di cluster.