Ricerca di nuovi target terapeutici nel carcinoma corticosurrenalico e studio dei meccanismi di azione del farmaco mitotane

Il carcinoma corticosurrenalico (ACC) è un tumore raro e altamente aggressivo che origina nella corteccia surrenalica, con una prognosi infausta dovuta al suo fenotipo maligno e alla mancanza di opzioni terapeutiche efficaci. Il fatto che a tutt’oggi non siano ancora state sviluppate terapie specifiche si deve attribuire alla scarsa conoscenza dei meccanismi patogenetici di questo tipo di tumore. L’unico farmaco attualmente in uso per il trattamento dei pazienti con ACC ad uno stadio avanzato è il mitotane, di cui tuttavia non sono ancora stati studiati i possibili effetti tossici a livello delle cellule surrenali tumorali e i meccanismi coinvolti. Il primo obiettivo di questo lavoro di tesi si è pertanto incentrato sullo studio dei profili di espressione proteica del tumore e della ghiandola surrenale sana, allo scopo di individuare proteine differenzialmente espresse e di conseguenza in grado di discriminare i due gruppi sperimentali. Lo studio è stato condotto mediante l’utilizzo della tecnica di 2D-DIGE (Differential In-gel Electrophoresis), utilizzata per la prima volta per questo tipo di tumore, che ci ha permesso di confrontare e quantificare i profili proteici di 19 campioni bioptici (11 tessuti tumorali e 8 tessuti surrenalici sani) corsi su gel differenti, grazie alla presenza di uno standard interno costituito da un pool proteico di tutti i campioni analizzati. La spettrometria di massa associata all’analisi DIGE ha identificato 22 proteine differenzialmente espresse (con un’ average ratio ≤-2 o ≥2 e una significatività statistica p<0.05) tra la condizione patologica e quella normale. La maggior parte delle proteine sono risultate overespresse negli ACC, ad eccezione di una downregolata, la tiosolfato sulfotransferasi. Per confermare la modulazione delle proteine identificate, abbiamo utilizzato due diverse metodiche: Western Blotting e immunoistochimica; la scelta delle proteine da validare si è basata sul ruolo che alcune di esse rivestono in alcune vie di segnalazione coinvolte nella tumorigenesi e nella progressione tumorale, ed in particolare abbiamo confermato l’espressione differenziale di ALDH6A1, TRANSFERRINA, FASCINA1, LAMINA A/C, CAP1 e ADX REDUTTASI (fold icrease+SE di 7.5±1.4, 3.6±1.2, 2.9±0.2, 2.6±2.1, 1.9±1.4, 1.6±0.8, p<0.05, rispettivamente) negli ACC rispetto alle surreni sane. In conclusione, i nostri risultati preliminari hanno identificato un profilo proteomico specifico per gli ACC, che si differenzia da quello dei tessuti surrenalici sani, e, all’interno di esso, abbiamo osservato il coinvolgimento di numerosi enzimi mitocondriali che potrebbero rappresentare dei validi biomarcatori per la diagnosi e lo sviluppo di terapie targetspecifiche, se ulteriormente validati in una coorte più estesa di pazienti. Se da un lato sono ancora in gran parte sconosciuti i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della progressione del tumore corticosurrenalico, e diventa quindi di fondamentale importanza l’utilizzo di differenti approcci per l’individuazione di nuovi possibili markers molecolari che permettano lo sviluppo di terapie più efficaci, dall’altro lato è altrettanto importante uno studio approfondito del meccanismo di azione del mitotane, che ad oggi rimane l’unico farmaco efficacie utilizzato per il trattamento dei pazienti con ACC allo stadio avanzato. Nonostante venga utilizzato da lungo tempo, infatti, non se ne conoscono i target intracellulari e molecolari, e uno studio approfondito potrebbe essere di aiuto per la scelta di eventuali molecole da somministrare in combinazione con esso per ridurne le dosi e ottenere degli effetti citotossici maggiori e maggiormente specifici. Nella seconda parte di questo lavoro, pertanto, siamo andati ad indagare gli effetti del mitotane a livello della linea cellulare di carcinoma corticosurrenalico, H295R, focalizzandoci sullo studio dei meccanismi intracellulari alla base del suo effetto tossico: in particolare, siamo andati ad analizzare le alterazioni nella morfologia e nella funzionalità dei mitocondri. Dopo aver osservato che il mitotane (DDD) viene metabolizzato e si accumula insieme al metabolita DDE all’interno delle cellule H295R in maniera dose-dipendente, abbiamo effettuato dei saggi di proliferazione che hanno confermato il suo effetto citotossico a livello delle cellule tumorali della corteccia surrenalica; in particolare, l’effetto del farmaco è evidente già a partire dalla dose di 10 micromolare dopo 48h di somministrazione, e raggiunge il suo effetto massimo dopo 7 giorni ad alte dosi (con un’inibizione della crescita tumorale del 92+1.12 % alla dose di 30 micromolare, corrispondente alla dose più bassa della finestra terapeutica del farmaco, dopo 7 giorni e significatività statistica p<0,0001). Successivamente siamo andati a valutare l’interessamento delle strutture intracellulari mediante analisi in microscopia elettronica: abbiamo osservato un’alterazione nella morfologia di questi organelli indotta dal mitotane in maniera dose- e tempo-dipendente; i mitocondri hanno mostrato un progressivo rigonfiamento, in concomitanza con una significativa diminuzione del numero delle creste interne. Dal momento che la riduzione nell’estensione del numero delle creste interne può interferire con la funzionalità mitocondriale, siamo andati a valutare se le alterazioni strutturali si riflettessero anche in un’alterazione della funzionalità di questi organelli. A questo scopo abbiamo valutato il potenziale di membrana in cellule vive in adesione, e abbiamo osservato una depolarizzazione dose-dipendente, che esita in una completa disgregazione degli organelli. Infine, per valutare se la depolarizzazione del potenziale di membrana influenzasse anche la respirazione, siamo andati a valutare il consumo di ossigeno in mitocondri vivi isolati da cellule H295R e abbiamo osservato una riduzione del consumo di ossigeno che sembra principalmente dovuta alla presenza di un danno di membrana (come confermato mediante esperimenti in Western Blotting) piuttosto che ad una specifica alterazione degli enzimi della catena respiratoria. Questi risultati contribuiscono a chiarire il meccanismo di azione del mitotane, mostrando che l’alterazione mitocondriale rappresenta uno dei principali bersagli dell’azione citotossica del farmaco. In conclusione, con questo lavoro sperimentale di tesi abbiamo individuato, mediante la tecnica 2D-DIGE, la presenza di un pattern proteico overespresso, specifico dell’ACC, e, all’interno di esso, abbiamo osservato il coinvolgimento di numerosi enzimi mitocondriali, che potrebbero rappresentare dei validi biomarcatori per la diagnosi dell’ACC. Con i dati di questo lavoro di tesi abbiamo quindi evidenziato che il mitocondrio rappresenta uno dei candidati più promettenti per lo sviluppo di nuove terapie target-specifiche, dal momento che anche il mitotane ha dimostrato di svolgere il suo effetto citotossico a livello di questo organello.