Progettazione, sintesi e valutazione farmacologica preliminare di modulatori delle proteine di trasporto coinvolte nella multidrug resistance (MDR)

Questa tesi di Dottorato si sviluppa nell’ambito della Multidrug Resistance, ovvero la resistenza multifarmaco, molto frequente in ambito oncologico. Infatti, una delle cause principali del fallimento della chemioterapia antitumorale è lo sviluppo da parte delle cellule tumorali, durante la terapia stessa, di resistenza verso uno o più farmaci caratterizzati da struttura chimica e meccanismo di azione molto differenti tra loro. Questo fenomeno è chiamato Multidrug Resistance ed è dovuto ad una sovraespressione di proteine di trasporto transmembrana appartenenti alla famiglia di trasportatori ABC. Queste proteine funzionano da pompe di estrusione utilizzando l’energia fornita dall’idrolisi dell’ATP per espellere dalla cellula tumorale contro gradiente di concentrazione il chemioterapico che così non riuscirà più a mantenere o raggiungere la concentrazione terapeutica efficace. La Pgp è la proteina di trasporto più studiata. E’ una glicoproteina di membrana ed è normalmente espressa nelle cellule sane dove ha una funzione fisiologica protettiva, essendo deputata all’espulsione di molecole lipofile e xenobiotici tossici. Sfortunatamente è sovraespressa nelle cellule tumorali in seguito ad una alterazione dell’espressione del gene MDR1, e ciò sfocia nella MDR. Il sito di legame di questa proteina è molto largo e contiene amminoacidi in grado di stabilire col substrato sia legami elettrostatici che idrofobici. E’ capace quindi di ospitare simultaneamente anche più ligandi con strutture molto diverse. La Pgp può essere quindi considerata come un possibile target terapeutico per superare la MDR. Il concetto è quello di cosomministrare il farmaco antitumorale con un modulatore della pompa (chiamato chemiosensibilizzante) che ne blocchi l’attività, in modo da ripristinare all’interno della cellula tumorale la giusta concentrazione di farmaco. Negli ultimi anni sono stati individuati diversi modulatori della Pgp ed alcuni di essi hanno raggiunto le prove cliniche anche se ancora nessun composto è stato approvato in terapia. E’ molto difficile stabilire relazioni struttura-attività per modulatori della Pgp perchè, così come i substrati, anche essi presentano le strutture più svariate. Comunque sono stati individuati dei requisiti strutturali importanti per conferire alle molecole buona attività anti-MDR, ovvero: elevata lipofilia, la presenza di gruppi accettori di legami ad idrogeno, gruppi aromatici e uno o più atomi di azoto protonabili a pH fisiologico. Inoltre, confrontando la struttura del Verapamile, primo composto riconosciuto attivo contro l’MDR, e della Pervilleina A, alcaloide tropanico con marcata attività anti-MDR appare evidente che queste molecole hanno una struttura comune in cui un atomo di azoto basico è legato, tramite linker, a due gruppi idrofobici aromatici. Sulla base di tutte queste considerazioni è da diversi anni che il gruppo di ricerca dove ho svolto il mio progetto di dottorato è coinvolto nella progettazione e sintesi di modulatori della Pgp con lo scopo di ottenere un ligande potente e selettivo, in grado di contrastare la MDR. Sono state quindi progettate diverse serie di molecole mantenendo tale motivo strutturale, ma variando la natura dei linker e dei residui aromatici. Nello specifico nel mio progetto di dottorato mi sono occupata della sintesi di molecole appartenenti • serie contenenti due funzioni esteree nelle quali variano la lunghezza e la flessibilità del linker utilizzato, oltre alla natura dei gruppi aromatici; • serie prive di residui esterei, ovvero analoghi ammidici isosterici e derivati alchilpiperazinici. L’attività anti MDR dei composti sintetizzati viene valutata tramite un test preliminare basato su un metodo spettrofluorimetrico, che misura l’uptake nucleare del chemioterapico fluorescente Pirarubicina (cosomministrata con varie concentrazioni della molecola in esame) in una linea cellulare eritroleucemica antraciclina-resistente che esprime solo la Pgp. Si ottiengono così una misura della potenza e dell’efficacia del composto. Come ulteriore approfondimento abbiamo ritenuto interessante valutare la stabilità in vitro di un set di molecole (data la presenza di due gruppi esterei nella struttura) in condizioni fisiologiche, cioè in PBS, e all’azione degli enzimi idrolitici del plasma. Inoltre la Pgp non è l’unica pompa di efflusso coinvolta nella resistenza crociata ai farmaci antitumorali. Hanno un ruolo molto importante anche altre due pompe appartenenti alla stessa famiglia di trasportatori ABC, ovvero MRP1 e BCRP. Quindi abbiamo ritenuto interessante valutare la selettività rispetto alle tre pompe coinvolte nella MDR. I risultati ottenuti indicano che i modulatori della Pgp sintetizzati nel corso degli anni a seguito di successive ottimizzazioni molecolari sono dotati di elevata potenza e efficacia, confermando indubbiamente che la presenza di un atomo di azoto basico collegato a due residui aromatici con linker di diversa natura ma di opportuna lunghezza sono caratteristiche importanti per avere inibizione della Pgp. Inoltre abbiamo trovato stereoselettività ed enantioselettività nell’interazione con la Pgp, caratteristica piuttosto rara in questo tipo di interazione.