Ruolo degli sfingolipidi bioattivi, Sfingosina 1-fosfato e Ceramide 1-fosfato, nell'atrofia muscolare.

L’atrofia muscolare scheletrica insorge come conseguenza fisiologica dell’ invecchiamento (sarcopenia) o di uno stile di vita sedentario ma può anche essere conseguenza di patologie come l'insufficienza cardiaca cronica (Bacurau et al., 2016), la malattia polmonare cronica ostruttiva (Passey et al.,2016), l'HIV (Pinto et al.,2016), la sepsi (Cohen et al.,2015) ed di alcuni disordini neuromuscolari, quali la distrofia muscolare di Duchenne e la sclerosi laterale amiotrofica (Thomas et al.,2007) o a seguito di tumore (cachessia). Prescindendo dall’evento scatenante, che implica sempre una mutifattorialità, l’atrofia muscolare è caratterizzata dalla diminuzione della massa e della funzione muscolare (Cruz-Jentoft et al.,2010) e, dal punto di vista bio-molecolare, dalla drastica riduzione del contenuto proteico per diminuzione della velocità di sintesi e aumento della degradazione proteica, in particolare delle proteine miofibrillari (Dedkov et al.,2003; Rudrappa et al.,2016). I principali meccanismi di proteolisi coinvolti nell’atrofia muscolare prevedono l’attivazione del sistema ubiquitina-proteasoma ed del sistema autofagico-lisosomiale (Milan et al.,2015). Sono due le ubiquitina ligasi, espresse specificatamente nel muscolo scheletrico: Muscle Atrophy F-box (MAFbx), definita anche Atrogin-1/MAFbx, e Muscle Ring Finger 1 (MuRF1) (Bilodeau et al., 2016; Bodine et al., 2014;. Cao et al., 2004). Questi enzimi promuovono l'ubiquitinazione di proteine bersaglio e la loro conseguente degradazione via proteasoma. Gli sfingolipidi (SLs), rappresentano una classe di molecole bioattive capaci di modulare il destino di molti tipi cellulari, tra cui le cellule del muscolo scheletrico (mioblasti). Infatti negli ultimi anni molti sono gli studi che sottolineano il ruolo fondamentale degli SLs nel mantenere la funzionalità e la vitalità delle fibre muscolari, quali la regolazione delle proprietà contrattili, la risposta a ormoni come l’insulina (Straczkowski M. et al., 2007), il controllo della fatica (Cowart L.A., 2010), ect. In particolare, S1P è implicata nell’attivazione delle cellule satelliti, cellule staminali residenti nel muscolo, favorendone l’attivazione, la proliferazione (Sassoli et al., 2014) ed il differenziamento, finalizzato alla rigenerazione del tessuto in seguito a danno (Danieli-Betto et al.,2009; Fortier et al., 2013; Germinario et al.,2012; Nagata et al.,2006). Poco è noto circa un possibile coinvolgimento di S1P nell’atrofia muscolare (De Larichaudy et al.,2012); vi sono invece alcune evidenze sperimentali riguardanti un’azione di protezione, come nel caso dell’azione protettiva in una fibra muscolare isolata soggetta ad esempio a denervazione (Ieronimakis et al., 2013; Zanin M. et al., 2008) o a contrazione eccentrica (Sassoli et al., 2011). Al momento non sono disponibili in letteratura dati riguardo il ruolo funzionale nella biologia delle cellule muscolari dell’altro sfingolipide bioattivo fosforilato, ceramide 1-fosfato (C1P). Per questo motivo, in questa tesi sperimentale è stato valutato il potenziale ruolo degli sfingolipidi bioattivi S1P e C1P e degli enzimi coinvolti nella loro sintesi, (sfingosina chinasi, SphK e ceramide chinasi, CerK rispettivamente), nella regolazione dei processi biologici deputati al mantenimento della massa muscolare. Lo studio è stato condotto inizialmente su un modello animale in vivo rappresentato da topi BalbC a cui è stata indotta cachessia mediante inoculazione sottocutanea di un frammento del tumore solido carcinoma C26 (Gorselink et al., 2006). Successivamente, al fine di caratterizzare il ruolo di S1P e C1P e le vie di segnalazione da essi promosse, le condizioni di atrofia sono state riprodotte in un modello cellulare in vitro rappresentato da cellule muscolari scheletriche differenziate della linea murina C2C12 in coltura, sottoposte al trattamento con desametasone (Dexa), un glucocorticoide in grado di indurne il passaggio ad un fenotipo atrofico, accelerando la degradazione proteica (Nakashima et al.,2016). In una prima fase, sono stati correlati i livelli d’espressione di Atrogin-1/MAFbx e MuRF1 ed l’espressione di SphK1 e CerK in biopsie di muscolo EDL (Extensor Digitorum Longus) di topi cachettici portatori di C26 e successivamente confermati in un modello cellulare di atrofia cioè in miotubi C2C12 trattati con Dexa. In entrambi i sistemi è stata dimostrata una correlazione tra l’asse SphK1/S1P e la comparsa di modificazioni morfologiche tipiche del fenotipo atrofico. Questi dati sono stati recentemente presentati al XIV congresso FISV 2016 presso l’Università di Roma, “La Sapienza” e sono parte di un manoscritto in preparazione. La S1P agisce come mediatore intracellulare ma negli ultimi venti anni è stata ampiamente caratterizzata la sua azione come molecola in grado di legare specifici recettori accoppiati a proteine eterotrimeriche leganti il GTP, denominati S1P1-5. Di questi sottotipi recettoriali solo tre sono espressi sul sarcolemma delle fibre muscolari: S1P1, S1P2, S1P3 (Ebenezer et al.,2016; Meacci et al., 2003; Pulkoski-Gross et al.,2015; Rosen et al., 2009). E’ stata riscontrata un’alterazione significativa dei livelli di espressione dei tre sottotipi recettoriali nei topi cachettici C26 e nei miotubi indotti ad atrofia da Dexa e delle loro vie di segnalazione a valle. In particolare, le vie di segnalazione a valle di S1P1 ed S1P2 possa contribuire all’induzione del fenotipo atrofico, mentre quelle a valle di S1P3 sembrano non rivestire un ruolo determinante. L’importanza di queste vie di segnalazione è stata confermata con agonisti ed antagonisti specifici dei vari sottotipi recettoriali ed i risultati ottenuti sono parte di un manoscritto in preparazione. La seconda parte di questa tesi sperimentale si è focalizzata su potenziali strategie per contrastare l’instaurarsi di un fenotipo atrofico e favorire la rigenerazione tissutale. A questo proposito, sono stati condotti esperimenti su cellule mesenchimali stromali derivate da midollo osseo (BM-MSCs). E’ stato infatti ampiamente dimostrato che il trapianto di cellule staminali mesenchimali nei tessuti muscolari murini danneggiati ha un grande potenziale terapeutico (Costamagna et al.,2015; Natsu et al.,2004; de la Garza-Rodea et al.,2011; von Roth et al.,2012) e che l’efficacia terapeutica sia principalmente attribuita alla loro abilità a secernere fattori in grado di promuovere meccanismi endogeni di riparazione tissutale in seguito a danno (Rose et al., 2008 ;Salem et al., 2010; Sassoli et al., 2012; Uccelli et al.,2008). In maniera interessante è stato dimostrato che le BM-MSCs sono in grado di rilasciare S1P nel mezzo di coltura e che la sintesi e il rilascio dello sfingolipide bioattivo possano giocare un ruolo importante sulla stimolazione della proliferazione dei mioblasti e di una coltura primaria di cellule satelliti (isolate da fibre muscolari murine EDL). Questi dati sono stati recentemente pubblicati sulla rivista internazionale PLOS ONE (Sassoli et al. 2014). Inoltre esperimenti preliminari hanno dimostrato una riduzione significativa dei livelli di espressione del fenotipo atrofico quando i miotubi sono stati incubati per 48 h con il mezzo condizionato delle BM-MSCs. Questi risultati sono stati presentati al 40° congresso FEBS 2015 in Berlino e alla conferenza internazionale "Molecular Medicine of Sphingolipids" 2016 in USA. Lo studio del ruolo del metabolismo degli sfingolipidi nel rimodellamento della matrice e nel differenziamento cellulare è stato esteso anche ai cardiomioblasti trattati con l’ormone peptidico relassina. Questo studio è stato recentemente pubblicato su Molecular Endocrinology (Frati et al., 2015) Infine, in vista dell'importanza di molti fattori antiossidanti contenuti naturalmente negli alimenti, si è iniziato ad estendere lo studio sulle proprietà nutraceutiche di un prodotto tipico della tradizione della Regione Toscana, Castanea sativa, ed in particolare ad uno dei suoi prodotti derivati. Estratti totali contenenti polifenoli e tocoferoli ottenuti dalla farina dolce di Castanea sativa, sono stati testati per la loro capacità di contrastare la comparsa in cellule muscolari differenziate del fenotipo atrofico. I risultati positivi sono stati recentemente pubblicati sulla rivista internazionale Food and Function (Frati et al.,2014). I dati presentati in questa tesi di dottorato, oggetto di due future pubblicazioni (Pierucci et al., 2017a, 2017b), mettono in evidenza il ruolo degli assi SphK1/S1P/S1PR e CerK/C1P come circuiti molecolari di regolazione della cellula muscolare scheletrica sia per quanto concerne le vie che portano alla degenerazione cellulare sia per quelle coinvolte nella regolazione del microambiente cellulare con un particolare sguardo all’ interazione funzionale tra cellule muscolari scheletriche, cellule mesenchimali stromali e cellule staminali coinvolte nella rigenerazione tissutale. Questi dati nel loro insieme contribuiscono a migliorare la comprensione della biologia delle cellule muscolari e mesenchimali importante per le potenzialità di una terapia cellulare orientata verso le alterazioni fisio-patologiche del muscolo scheletrico.