Tumorsfere come strumento per l'ottimizzazione delle condizioni di coltura delle cellule tumorali circolanti (CTC)

Il rilevamento, l’isolamento e caratterizzare le CTC (biopsia liquida) rappresenta il presupposto per la dimostrazione della validità clinica nella gestione del paziente oncologico. Attualmente esistono numerose tecnologie per l’arricchimento delle CTC e il loro successivo utilizzo. Tuttavia anche con tali metodi, il numero esiguo di CTC è limitativo per l’esecuzione di test funzionali e farmacologici. Scopo di questa tesi è lo sviluppo di un protocollo per l’arricchimento e la successiva coltura di cellule tumorali circolanti da campioni di sangue di pazienti oncologici mediante un metodo basato sulle caratteristiche fisiche delle CTC quali le dimensioni e la deformabilità. Gli esperimenti hanno individuato una procedura in grado di assicurare un elevato recupero di cellule dal sangue mantenendone la sterilità per la successiva coltivazione in vitro. Lo studio delle condizioni ottimali di coltura per questa specifica applicazione ci ha portato a valutare gli effetti del sangue intero e delle sue componenti, come il plasma e i lisati piastrinici, sulle cellule modello del nostro studio. Il risultato del lavoro è stato la messa a punto di un metodo in grado di poter recuperare più del 90% delle cellule tumorali aggiunte ad un campione di sangue creato per mimare il reale prelievo di un paziente. Il conteggio delle cellule recuperate è stato eseguito dopo marcatura con un tracciante fluorescente. Il materiale recuperato si è dimostrato sterile, condizione essenziale per la realizzazione di una coltura cellulare. L’utilizzo delle colture 3D ha permesso di lavorare con cellule quanto più simili alle CTC reali. L’introduzione di un transwell nel protocollo di recupero, in grado di separare la zona deputata alla coltura delle CTC da quella sottostante contenente gli stimoli, ha permesso di modificare il microambiente per la crescita cellulare consentendo l’aggiunta di stimoli opportuni in fasi diverse del protocollo. L’utilizzo del protocollo su un campione prelevato da un paziente metastatico con diagnosi di NSCLC ha permesso l’ipotetico recupero di CTC di cui una è risultata sterile e vitale per circa un mese. L’utilizzo di nuovi campioni biologici e l’ampliamento della casistica d’indagine permetteranno la validazione della procedura e l’inserimento di modifiche sulla base del comportamento delle vere CTC in coltura.