Effetti biofisici e biomeccanici generati dai trattamenti ad ultrasuoni a bassa intensità su sferoidi tumorali pancreatici: modellazione agli elementi finiti e sperimentazione in vitro.

Le applicazioni degli ultrasuoni(US) in campo medico per i trattamenti terapeutici sono da almeno 2 decenni sotto la lente di ingrandimento da parte di numerosi gruppi di ricerca che hanno messo a punto numerosi setup sperimentali ed attraverso i quali hanno individuato diversi protocolli promettenti che inducono effetti biologici e biomeccanici sulle cellule dei tessuti trattati: le divergenze delle sperimentazioni che si possono individuare in letteratura risiedono principalmente nella dimensione della sonda ad US, il range di frequenze utilizzate, l’intensità del campo acustico, il tempo di esposizione, il tipo di tessuto trattato, lo stadio di oncogenesi delle cellule trattate e la modalità di stimolazione (contatto/distanza). Una chiara distinzione è però individuabile in base all’intensità degli US ed al conseguente andamento della temperatura durante il trattamento, infatti se quest’ultima rimane in un range di ± 2°C si può ragionevolmente ritenere che gli effetti indotti sulla struttura cellulare sono di tipo meccanico. La sonoporazione o la sonicazione sono due particolari effetti che possono condurre la cellula ad apoptosi e sono generati da un processo di cavitazione acustica (stabile o instabile) attraverso l’applicazione di un trattamento a Low Intensity (Continuous/Pulsed) Ultrasound (LICUS/LIPUS). Nel caso alternativo in cui l’aumento di temperatura sia l’effetto predominante con incrementi che possono raggiungere gli 80-100°C si parla di trattamenti ipertermici, identificabili in letteratura come High Intensity Focused Ultrasound (HIFU). Questo lavoro di tesi si focalizza sui trattamenti ad US a bassa intensità ponendosi come obiettivo finale l’individuazione di un protocollo di stimolazione efficace per indurre un processo di apoptosi/lisi/disgregazione di un agglomerato di cellule (sferoide) tumorali. Per raggiungere tale obiettivo ed associare ai risultati una correlazione tra gli effetti biofisici e biomeccanici indotti dal trattamento ad US nella cultura cellulare bersaglio e le sue proprietà costitutive meccaniche sono stati esplorati più metodi di analisi microscopica. Dai risultati delle analisi condotte è stato possibile acquisire le informazioni necessarie alla costituzione di un modello tridimensionale robusto e condurre su di esso delle analisi agli elementi finiti: simulazione di campo di pressione acustica transitorio a diverse frequenze (1,2,3,5 MHz) per la valutazione dello stato di stress generato. Al termine della fase di simulazione del protocollo da testare in vitro si è proceduto con la fase di validazione dei risultati di simulazione attraverso una sperimentazione in vitro che ha richiesto la progettazione e messa in opera di un setup ad US ad immersione dedicato alla stimolazione di culture cellulari 3D(sferoidi) di tumorali pancreatici (Panc-1). Questa fase estremamente delicata ha richiesto il costante coordinamento di un team multidisciplinare (Biologi, Ingegneri, Medici) ed interdipartimentale (Dipartimento di Ingegneria Industriale DIEF, Dipartimento di Ingegneria Dell’Informazione DINFO, Dipartimento di Medicina Sperimentale e Clinica DMSC): da questa collaborazione è nato un robusto protocollo operativo sperimentale che ha permesso di raggiungere ragguardevoli risultati di ricerca nonostante il difficile periodo pandemico. In questo elaborato saranno enucleati in modo più chiaro possibile i passi che sono stati effettuati per raggiungere gli obiettivi prefissi, questo al fine di rendere ripetibile la sperimentazione condotta anche su altre tipologie di cellule con la speranza che questa attività di ricerca possa aprire la strada verso la realizzazione e la sperimentazione di un dispositivo ad US selettivo per il trattamento percutaneo oncologico. ____________________________________________________________________________________________________________________________________________ The applications of ultrasound (US) in the medical field for therapeutic treatments have been under the magnifying glass for at least 2 decades by numerous research groups that have developed numerous experimental setups and through which they have identified several promising protocols that induce biological and biomechanical effects on the cells of the treated tissues: the divergences of the experiments that can be identified in the literature mainly reside in the size of the US probe, the range of frequencies used, the intensity of the acoustic field, the exposure time, the type of treated tissue, the stage of oncogenesis of the treated cells and the modality of stimulation (contact / distance). However, a clear distinction can be identified based on the intensity of the US and the consequent temperature trend during treatment, in fact if the latter remains in a range of ± 2 ° C it can reasonably be assumed that the effects induced on the cellular structure are of mechanical type. Sonoporation or sonication are two particular effects that can lead the cell to apoptosis and are generated by a process of acoustic cavitation (stable or unstable) through the application of a Low Intensity (Continuous / Pulsed) Ultrasound (LICUS / LIPUS) treatment. In the alternative case in which the temperature increase is the predominant effect with increases that can reach 80-100 ° C we are talking about hyperthermic treatments, identifiable in the literature as High Intensity Focused Ultrasound (HIFU). This thesis focuses on low-intensity US treatments with the ultimate goal of identifying an effective stimulation protocol to induce a process of apoptosis / lysis / disintegration of an agglomeration of tumor cells (spheroid). To achieve this objective and to associate the results with a correlation between the biophysical and biomechanical effects induced by the US treatment in the target cell culture and its mechanical constitutive properties, several methods of microscopic analysis were explored. From the results of the analysis it was possible to acquire the information necessary to build a robust three-dimensional model and conduct finite element analysis on it: simulation of a transient acoustic pressure field at different frequencies (1,2,3,5 MHz) for the evaluation of the state of stress generated. At the end of the simulation phase of the protocol to be tested in vitro, we proceeded with the validation phase of the simulation results through an in vitro experimentation which required the design and implementation of a US immersion setup dedicated to the stimulation of cultures. 3D cells (spheroids) of pancreatic tumors (Panc-1). This extremely delicate phase required the constant coordination of a multidisciplinary team (Biologists, Engineers, Doctors) and interdepartmental (DIEF, DINFO, DMSC): from this collaboration a robust experimental operational protocol was born which allowed to achieve remarkable research results despite the difficult pandemic period. In this paper the steps that have been taken to achieve the objectives will be enucleated as clearly as possible, in order to make the experimentation conducted on other types of cells repeatable with the hope that this research activity can pave the way towards the realization and experimentation of a selective US device for percutaneous oncological treatment.