Gli effetti del glucagone e degli agonisti del GLP-1R in un modello di precursori adiposi umani Effects of glucagon and GLP-1 receptors agonists on human adipose precursors

Lo sviluppo di obesità si associa ad una disfunzione del tessuto adiposo bianco (WAT) e a disregolazione della funzione adipocitaria. Il tessuto adiposo bruno (BAT), a differenza di quello bianco, accumula un minor quantitativo di lipidi che trasforma in calore esercitando una funzione di regolazione positiva sull’equilibrio metabolico. Per questo motivo, se da una parte vi è un crescente interesse nella ricerca di nuove strategie terapeutiche basate su un’azione diretta sul tessuto adiposo bianco, allo stesso tempo risulta rilevante la possibilità di stimolare il tessuto adiposo bruno nell’adulto a scapito dell’espansione anomala e disfunzionale del WAT in caso di disordini patologici, quali l’obesità e il diabete mellito di tipo 2. Gli agonisti del recettore del glucagon-like peptide 1 (GLP-1Ras), ampiamente utilizzati nella terapia del diabete di tipo 2, hanno mostrato risultati promettenti anche sulla riduzione del peso corporeo, rivelandosi agenti terapeutici per il trattamento dell’obesità. In un recente studio preclinico, il nostro laboratorio ha dimostrato che diversi GLP-1Ras (GLP-1 nativo, liraglutide) interferiscono con la capacità proliferativa e differenziativa di cellule staminali adulte umane derivate da tessuto adiposo bianco sottocutaneo (S-ASC), ipotizzando un’azione diretta sul comparto adiposo. A seguito di queste evidenze, abbiamo ritenuto interessante prendere in considerazione un altro ormone chiave nella regolazione dell’omeostasi metabolica, il glucagone, prodotto del gene pro-glucagone insieme al GLP-1 a partire da un precursore sottoposto a splicing postrascrizionale. Lo scopo della prima parte di questo lavoro è stato quello di valutare gli effetti di dose crescenti di glucagone (1-10-100 nM) sulla capacità proliferativa delle S-ASC e sulla loro capacità differenziativa verso l’adipocita bianco maturato in vitro. Il glucagone induce un’inibizione tempo e dose dipendente della proliferazione delle S-ASC, valutata con esperimenti di conta cellulare diretta e analisi citofluorimetrica, con un effetto massimo a 3 giorni (14.00%, 25.16%, 37.11% di inibizione per glucagone 1-10-100 nM, rispettivamente). Gli effetti anti-proliferativi sono stati confermati mediante saggi di incorporazione della timidina triziata. Dagli esperimenti di citofluorimetria con l’annessina V, la somministrazione di glucagone non determina l’attivazione precoce del processo apoptotico, mentre la valutazione del ciclo cellulare ha evidenziato una riduzione del numero di cellule che entrano nella fase S. Durante esperimenti di differenziamento adipocitario in presenza di dosi crescenti di glucagone è stata osservata una riduzione degli accumuli lipidici rispetto alle cellule non trattate (20%, 31% e 27% per glucagone 1-10-100 nM, rispettivamente). L’effetto inibitorio sull’adipogenesi è stato confermato dalla riduzione dell'espressione di marcatori dell’adipocita maturo, come HSL e FABP4 e di marker più precoci, come PPARγ. A differenza di quanto atteso sulla base dell’effetto opposto degli agonisti del GLP-1 e del glucagone sul controllo glicemico, sulle S-ASC, i due tipi di molecole presentano effetti simili. Abbiamo valutato, quindi, l’espressione proteica del recettore del GLP-1 (GLP-1R) e del recettore del glucagone (GCGR) mediante tecniche diverse (analisi citochimica ad immunofluorescenza, analisi citofluorimetrica e Western Blot), confermando gli effetti diretti dei GLP-1RAs e del glucagone sul comparto staminale adiposo. Inoltre, con l’obiettivo di definire i meccanismi molecolari convolti nell’azione del GLP-1 e del glucagone sui precursori adiposi umani e di chiarire il ruolo di entrambi i recettori che mediano tali effetti simili, abbiamo utilizzato l’antagonista specifico del recettore del glucagone, des-His1- [Glu9]-glucagon(1–29) e, in parallelo, l’antagonista del recettore del GLP-1, exendin(9-39). I risultati ottenuti dagli esperimenti di conta cellulare diretta hanno dimostrato che l’effetto inibitorio del glucagone sulla proliferazione delle S-ASC è significativamente revertito, non solo dall’antagonista specifico del GCGR (86, 103, 97% per 1, 2 e 3 giorni, rispettivamente), ma anche dall’antagonista selettivo del GLP-1R (88, 96, 91% per 1, 2 e 3 giorni, rispettivamente). Analogamente, abbiamo utilizzato gli antagonisti per valutare gli effetti sulla capacità differenziativa della cellula precursore e, con entrambi gli agonisti, si osserva una significativa reversione dell’azione inibitoria del glucagone sull’adipogenesi in vitro. Lo scopo della seconda parte del lavoro è stato quello di comparare gli effetti di glucagone, liraglutide e GLP-1(7-36) sulla riduzione del differenziamento adipogenico in vitro delle S-ASC e, nello specifico, di indagare l’azione di queste tre molecole sulla stimolazione del processo di differenziamento in adipociti di tipo bruno (browning). La significativa inibizione della capacità di accumulare trigliceridi (% inibizione: 24, 40 e 23% vs ADIPO) è stata valutata mediante saggio quantitativo AdipoRed e confermata anche in microscopia ottica (mediante colorazione Oil Red O) e in epifluorescenza (AdipoRed). Mediante analisi TaqMan, è stata valutata l’espressione genica di alcuni marcatori caratteristici del lineage adipocitario bianco e abbiamo osservato che le cellule differenziate in presenza delle tre molecole mostrano una ridotta espressione di FABP4, ma più elevati livelli di adiponectina, suggerendo un miglioramento funzionale dei pochi adipociti differenziati in vitro. Per valutare la stimolazione del processo di browning abbiamo utilizzato come controllo positivo un modello umano già caratterizzato di una popolazione primaria di cellule staminali adipose bianche contenenti precursori brite (B-ASC), isolate dal grasso viscerale che riveste la surrene affetta da feocromocitoma, condizione in cui i livelli elevati di catecolamine prodotte dal tumore inducono il lineage bruno. Sono stati eseguiti esperimenti di differenziamento adipogenico in vitro delle B-ASC con mezzo di induzione classico e addizionato con noradrenalina, osservando che indipendentemente dal cocktail differenziativo utilizzato si ottengono adipociti bruni maturi, come confermato dall’elevata espressione di UCP-1 mediante analisi TaqMan. La natura brite e non bruna classica del nostro controllo positivo è stata poi confermata dalla positività per l’espressione di due marcatori della staminalità brite, TBX1 e CD137. Abbiamo quindi indagato, mediante analisi TaqMan, i livelli di espressione dei geni marcatori del fenotipo bruno PRDM16 e UCP-1 nelle S-ASC differenziate in vitro in presenza di glucagone, liraglutide e GLP-1(7-36) (dose 10 nM), osservando rispettivamente una up-regolazione dell’espressione di UCP-1 (2.13, 2.48 e 2.14 vs ADIPO). Infine, a supporto del fatto che la stimolazione con glucagone, liraglutide e GLP-1(7-36) determina uno shift verso fenotipo bruno delle S-ASC indotte, è stata valutata la funzionalità e morfologia dei mitocondri negli adipociti indotti a differenziare in presenza delle tre molecule. Come saggio funzionale abbiamo utilizzato l’analizzatore Seahorse con test Mitostress che effettua la misurazione della respirazione mitocondriale in relazione al rate di consumo di ossigeno (OCR). I risultati ottenuti mostrano che gli adipociti differenziati in vitro in presenza di glucagone, liraglutide e GLP-1(7-36) presentano un aumento della massima respirazione e una riduzione significativa della produzione di ATP. Per l’analisi morfometrica mitocondriale, gli adipociti differenziati in vitro e trattati con le tre molecole sono stati analizzati mediante microscopio elettronico a trasmissione. Dai dati ottenuti, negli adipociti differenziati con l’aggiunta di glucagone, liraglutide e GLP-1(7-36) al mezzo di induzione i mitocondri risultano più numerosi, con un aumento dell’area e del perimetro superficiale. Questo lavoro dimostra in conclusione un effetto diretto del glucagone e dei GLP-1Ras, liraglutide e GLP-1, nell’indurre un significativo miglioramento della qualità dei precursori adipocitari in vitro, determinando uno shift metabolico dei precursori verso un differenziamento di tipo bruno, dimostrando quindi una azione delle molecole a livello periferico nel tessuto adiposo, compatibile con l’effetto descritto sull’obesità da parte dei GLP-1Ras. Inoltre, questo studio evidenzia per la prima volta l’attività diretta del glucagone sul precursore adipocitario con meccanismo a comune con I GLP-1Ras. Questi risultati aprono quindi nuovi orizzonti sulla possibile modulazione a livello periferico della disfunzione adiposa alla base dello sviluppo di trattamenti terapeutici ad azione locale fondati sull’attività del GLP-1R.