Dental calculus and associated diseases: evolution of the human oral microbiome from medieval skeletal collection to today

La cavità orale umana ospita una ricca e diversificata flora microbica la quale costituisce il “microbiota orale” (MO), secondo per abbondanza solo al microbiota intestinale. Data questa sua notevole rilevanza, il MO è stato negli ultimi anni largamente impiegato per la messa a punto di nuove metodologie diagnostiche (soprattutto grazie alla facilità di campionamento); inoltre, eventi di disbiosi del MO, sono stati associati all’insorgenza di numerose condizioni patologiche sia locali (carie, parodontite) che sistemiche (artrite reumatoide, malattie cardiovascolari, diabete, ecc). Di recente, sul MO ha posto i riflettori anche la medicina evoluzionistica, a seguito delle differenze di suscettibilità alle malattie mostrate dai nostri antenati che sono state documentate grazie a studi molecolari condotti sul tartaro dentale o dental calculus. Questo infatti, durante la sua formazione, determina la calcificazione in situ sia delle cellule batteriche che di eventuali detriti alimentari, ma soprattutto di molecole di DNA che, sebbene molto danneggiate, possono essere analizzate dalle nuove tecniche di sequenziamento ultramassivo. Durante questo progetto di dottorato è stata effettuata un’analisi composizionale e funzionale del MO a partire da substrati di DC ottenuti sia da pazienti sottoposti a cure dentali che da campioni archeologici, risalenti ad un arco temporale diacronico che si estende dal Paleolitico Superiore all’età medioevale. L’obiettivo primario di tale tesi è stato quello di valutare l'evoluzione dell’ecologia microbica del cavo orale e meglio comprendere l’associazione tra le modificazioni del MO, dovute principalmente alle abitudini alimentari, e l’insorgenza di patologie orali ed extra-orali in tempi recenti. Inoltre, un ulteriore focus di questo progetto è stato l’identificazione di microrganismi che sono stati putativamente persi o acquisiti nel corso della storia e che potrebbero essere associati a patologie sia locali che sistemiche. Le analisi oggetto di studio sono state condotte mediante due differenti approcci molecolari. Se da un lato infatti i normali protocolli attuati su materiale moderno si basano sul sequenziamento di una o alcune delle regioni ipervariabili del gene ribosomale 16S, gli approcci legati all’analisi di materiale antico prediligono il sequenziamento shotgun. In questo lavoro pertanto, il DC di 14 individui moderni è stato confrontato mediante sequenziamento delle regioni V3 e V4 del gene 16S rRNA con i profili recuperati da 14 campioni medioevali pubblicati nell’unico lavoro riportato in letteratura in cui è stata utilizzata una metodologia di sequenziamento comparabile. Inoltre, il DC di 6 individui moderni è stato sequenziato mediante approccio shotgun, ed i risultati prodotti sono stati confrontati con quelli ottenuti da 22 individui archeologici. Per tale studio sono stati seguiti i protocolli specificamente sviluppati per il recupero di materiale antico mentre le pipeline bioinformatiche utilizzate per l’analisi dei dati sono state modificate ad hoc, in modo da rendere totalmente confrontabili i due dataset oggetto di studio. L’analisi dei dati ottenuti mediante sequenziamento 16S ha messo in evidenza la prevalenza nei campioni antichi del phylum Proteobacteria ed una elevata abbondanza del phylum Actinobacteria; i campioni moderni presentano invece una maggiore abbondanza dei phyla Firmicutes, Bacteroidetes e Fusobacteria. Il confronto a livello di genere ha documentato invece l’elevata abbondanza di Prevotella spp., Porphyromonas spp. e Fusobacterium spp. nei campioni moderni di DC mentre i campioni antichi hanno mostrato una maggiore prevalenza di Actinomyces spp. Queste analisi hanno quindi dimostrato la presenza nel DC ottenuto da campioni moderni, rispetto a quello ricavato da campioni antichi, di un maggior numero di microrganismi associato ad una condizione di disbiosi orale e quindi potenzialmente responsabili dell’insorgenza di patologie. Il confronto dei risultati ottenuti mediante sequenziamento shotgun ha mostrato, da un punto di vista della struttura del MO, la netta distinzione tra la totalità dei campioni antichi e quelli moderni, per tutte le categorie tassonomiche. In dettaglio, i phyla più abbondanti nei campioni antichi sono risultati Actinobacteria, Proteobacteria, Firmicutes e Bacteroidetes mentre i campioni moderni, oltre a quelli appena citati, hanno mostrato anche elevati livelli di Spirochaetes. A livello di genere, invece, i microrganismi maggiormente rappresentati nei campioni antichi, sono Actinomyces, Olsenella, e Streptococcus mentre i campioni moderni hanno evidenziato un elevata abbondanza di Treponema spp., comunemente associato a patologie orali oltre a ridotti livelli di Neisseria spp., notoriamente considerato un batterio benefico per la salute orale. I campioni moderni hanno riportato anche la presenza di Porphyromonas gingivalis, assente invece in tutti i campioni antichi, largamente associata a patologie sia orali che extraorali. Considerati questi risultati, l’approfondita profilazione del microbiota orale mediante tecnologie “omiche” potrà quindi essere fondamentale sia per la definizione di alterazioni composizionali e/o metaboliche associate agli stati di malattia che, per lo sviluppo di farmaci e terapie mirate allo scopo di rendere la medicina sempre più personalizzata e di precisione.