Implementation of a low-cost and automated platform for image-based plant phenotyping: 3D reconstruction, traits extraction and modeling applications

[ENGLISH] In crop science, phenotyping refers to the characterization of the plant traits controlled by genetic and environmental factors. Systematic quantification of plant phenotypes is the pillar of any breeding program as a main driver for genetic gain in adaptive and productive crop potential. Conventionally, measuring phenotype is a labour-intensive, time-consuming and error-prone task. Although crop breeding has benefited from rapid advances in next-generation genomics, the accurate and high-throughput phenotyping of complex traits remains a critical bottleneck. Image-sensing and data mining may represent useful approaches to be integrated in new affordable phenotyping platforms for an ad-hoc quantification of the main plant traits. Accordingly, the aim of this thesis is to implement a novel low-cost and automatic platform for the comprehensive analysis of complex phenotypes modelled in three-dimension (3D), which are closely linked to the plant physiological performance under a limiting environment. The new phenotyping platform is presented in Chapter 3 where the hardware core, consisting of sensing modules and rotating plates, and the plant 3D-modeling workflow are described. The platform was tested to reproduce the main phenotypic traits of potted plant species with distinct canopy architectures (e.g., maize, tomato and olive tree), which were modelled in 3D from digital images acquired at a different frequency (steps of 4°, 8° and 12°) and quality (4.88, 6.52 and 9.77 µm/pixel). The results indicated that best performances in reconstruction process were associated with unviable requirements in terms of input (90 images at 4.88 µm/pixel resolution) and time (from 2.46 h to 28.25 h for herbaceous plants and olive trees, respectively). To improve the throughput of encoding plant 3D-models into holistic and component descriptors, a proper balance between the number of images and their resolution was identified (30 images at 4.88 µm/pixel). These findings proved the effectiveness of the proposed pipeline in plant phenotyping, also revealing how specific input combinations must be chosen depending on the complexity of the target shape to be analyzed. As detailed in Chapter 4, the platform was integrated with a novel algorithm for the automatic, organ-level segmentation and high-throughput phenotyping of plant 3D-models. The algorithm showed satisfactory performances when initially tested for extracting the main phenotypic components of four potted tomato cultivars. Specifically, 95.74% of the plant limbs (i.e., stem, petioles and leaves) were correctly segmented and the relevant morphometric traits accurately measured (error ≤ 10%). Based on these results, the phenotyping pipeline was subsequently applied for monitoring dynamic morpho-physiological responses of the same plants to different water deficit treatments (full-irrigation, 50% deficit irrigation and no-irrigation) at early developmental stages. To this end, the Fraction of Transpirable Soil Water (FTSW) was derived by automatically weighing each pot on the platform and combined with growth phenotypic data to effectively detect the onset of water stress. Notably, daily plant growth rate resulted in the most responsive phenotypic trait to early water stress, highlighting how slow-growth of the tomato canopy can be an adaptive mechanism to better compensate for the scarcity of soil moisture. Thus, this study confirmed that the proposed phenotyping pipeline could be exploited as a selection tool for quickly breeding more drought tolerant crop cultivars. Finally, the proposed phenotyping platform was validated against two existing phenomics facilities, namely the LemnaTec® Scanalyzer and the HP® David SLS-3 stations, by comparing the performance in quantifying plant growth traits as proxies of above-ground fresh/dry biomass accumulation (Chapter 5). First, the accuracy of each sensing platform was successfully tested in capturing the major morphometric components of scanned maize and tomato potted plants, which then were used as dynamic predictors for biomass. Results highlighted how the combination of the canopy’s concave shape with the age of the plant significantly improved the accuracy of biomass estimation for all the species and growth stages considered in the study. The comprehensive comparison between the different methodologies allowed to provide insights for the optimal selection of species-specific phenotyping strategies aimed at quantifying complex traits in a non-destructive, accurate and high-throughput manner. In this context, our platform guaranteed the greatest accuracies in predicting the biomass accumulation of more compact canopies with increased organ overlaps and self-occlusions (e.g., tomato), as a precise and efficient plant 3D-modeling was required to accurately recover the surface occupied by the innermost vegetative structures. This demonstrated how the platform implemented in the PhD thesis can effectively replace conventional methods of collecting phenotypic data, also improving the performance of existing technologies of greater complexity in predicting biomass trajectories on a daily scale. [ITALIANO] Per fenotipizzazione vegetale si intende il processo attraverso il quale è possibile caratterizzare il complesso dei tratti morfologici e funzionali di una pianta (fenotipo), frutto dell'influenza reciproca tra i geni (genotipo) e l'ambiente in cui essa si accresce. La quantificazione sistematica della variabilità fenotipica degli organismi è dunque fondamentale per incrementare il potenziale produttivo delle colture, attraverso la selezione di genotipi più resilienti a specifiche condizioni di crescita. Tuttavia, lo studio del fenotipo si basa, convenzionalmente, su rilievi manuali che risultano essere imprecisi ed altamente dispendiosi in termini di lavoro e tempo, oltreché incompatibili con i più moderni programmi di miglioramento genetico ad elevato rendimento. Per questo motivo, lo sviluppo di piattaforme di fenotipizzazione a basso costo, che integrino sistemi automatici di acquisizione ed elaborazione di immagini, è di primaria importanza per la quantificazione efficiente e non distruttiva dei principali caratteri fenotipici di interesse selettivo ed agronomico. In quest’ottica, l’obiettivo della presente tesi è quello di implementare una nuova piattaforma, automatica ed economica, in grado di analizzare le principali caratteristiche morfologiche e fisiologiche di piante sottoposte a condizioni di crescita limitanti, a partire dalla loro ricostruzione tridimensionale (3D) basata su immagini. La struttura di tale piattaforma è presentata nel Capitolo 3, nel quale viene anche descritta la metodologia utilizzata per la modellazione 3D. A tal proposito, si sono acquisite immagini digitali a diversa frequenza (un’immagine ogni 4, 8 e 12 gradi) e qualità (4.88, 6.52 e 9.77 µm/pixel) di piante in vaso caratterizzate da architetture della chioma contrastanti (mais, pomodoro ed olivo) che sono state poi elaborate per testare l’efficacia della piattaforma nella loro ricostruzione in 3D. I risultati hanno indicato come la maggiore accuratezza di modellazione fosse associata ad eccessivi requisiti in termini di input (90 immagini con una risoluzione di 4,88 µm/pixel) e tempo (da 2.46 a 28.25 ore necessarie per la ricostruzione, rispettivamente, di piante erbacee e legnose). Di conseguenza, si è provveduto ad individuare la combinazione ottimale dei fattori (numero e risoluzione delle immagini) che consentisse di incrementare l’efficienza del processo di ricostruzione senza comprometterne l’accuratezza (30 immagini a 4,88 µm/pixel). Lo studio ha, dunque, dimostrato l'efficacia della piattaforma nella fenotipizzazione vegetale ad alto rendimento, rivelando altresì la necessità di adottare specifiche combinazioni di input per efficientare la modellazione di strutture vegetali a diversa complessità geometrica. Al fine di incrementare ulteriormente il rendimento della piattaforma, è stato sviluppato un innovativo algoritmo per la segmentazione automatica dei modelli 3D a livello del singolo organo e per la successiva estrazione dei principali parametri morfometrici (Capitolo 4). Dapprima, l'algoritmo è stato testato nella fenotipizzazione di quattro cultivar di pomodoro, risultando in un’accurata segmentazione di steli, piccioli e foglie (95.74%) ed in una altrettanto accurata misurazione delle relative geometrie (errore ≤ 10%). Sulla base di queste evidenze, è stato poi possibile applicare l’intero processo di fenotipizzazione nel monitoraggio delle dinamiche morfo-fisiologiche delle stesse piante in risposta a diversi trattamenti irrigui (irrigazione ottimale, deficitaria del 50% e nulla). Al fine di rilevare l’insorgenza dello stress già dalle prime fasi di crescita, la frazione di acqua traspirabile presente nel suolo (FTSW), derivata pesando automaticamente ciascun vaso sulla piattaforma, è stata combinata con i dati fenotipici estratti dai modelli. Il tasso di crescita giornaliero delle piante è risultato il tratto maggiormente sensibile a decrementi nella disponibilità idrica, evidenziando come un più lento accrescimento della chioma possa essere considerato un meccanismo di adattamento allo stress nel pomodoro. Pertanto, questo studio ha confermato come la presente piattaforma possa essere impiegata anche nella selezione rapida ed efficace di cultivar più resilienti alla siccità. Infine, l’affidabilità della piattaforma nella quantificazione di tratti fenotipici, utili alla stima dell’accumulo di biomassa fresca e secca, è stata testata in relazione alle prestazioni di altri due sistemi di fenotipizzazione già esistenti, vale a dire le stazioni LemnaTec® Scanalyzer e HP® David SLS-3 (Capitolo 5). Innanzitutto, si è dimostrata l'accuratezza di ciascuna piattaforma nella scansione dei principali caratteri morfometrici di piante in vaso di mais e pomodoro, che sono stati poi utilizzati come variabili di modelli predittivi della biomassa. I risultati hanno evidenziato come l’estrazione dell’area occupata dalla chioma, in combinazione con l'età della pianta, garantisca la maggior accuratezza estimativa per tutte le fasi di crescita considerate, permettendo di individuare la strategia più adeguata alla fenotipizzazione non distruttiva, puntuale e ad alto rendimento di ogni singola specie. In tal senso, la piattaforma qui proposta si è rivelata la più performante nella previsione dell'accumulo di biomassa in chiome compatte e con un maggior numero di organi occlusi e sovrapposti (come nel caso del pomodoro), dal momento in cui si è resa necessaria un’efficiente modellazione 3D della pianta per il recupero della superficie occupata dalle strutture vegetali più interne. Ciò ha dimostrato come la piattaforma, implementata nella tesi di dottorato, possa sostituire i metodi convenzionalmente utilizzati per lo studio del fenotipo vegetale, addirittura migliorando le prestazioni di tecnologie già esistenti e a maggior grado di complessità nella previsione della dinamica giornaliera dell’accumulo di biomassa.