Next Generation Sequencing: diagnosi di casi sporadici di sindrome nefrosica steroido resistente in età pediatrica

Si definisce sindrome nefrosica steroido-resistente (SNSR), un quadro di nefrosi che non si risolve dopo 4 settimane di terapia con corticosteroidi. Rappresenta il 20% delle sindromi nefrosiche nel bambino e, nella maggior parte dei casi, si associa ad un quadro istopatologico di glomerulosclerosi focale segmentale1. Questa condizione ha molto spesso una base genetica; ad oggi sono stati descritti almeno 15 geni podocitari, le cui mutazioni, per lo più recessive, sono state associate alla sindrome2. I geni malattia codificano per fattori di trascrizione del podocita, proteine del complesso della slit diaphragm, proteine del citoscheletro podocitario, proteine citoplasmatiche, mitocondriali e proteine della membrana basale glomerulare. Questa condizione è caratterizzata non solo da eterogeneità genetica, ma anche da variabilità fenotipica, sia per età d'esordio che per gravità del quadro clinico, che molto spesso è il risultato di un genotipo composto, con mutazioni a carico di più geni podocitari. Per questi motivi la SNSR risulta essere una condizione difficile da studiare con le tradizionali metodiche di biologia molecolare: numerosi geni dovrebbero, infatti, essere analizzati uno dopo l'altro per poter raggiungere un'appropriata diagnosi molecolare, cosa spesso non fattibile in termini di costi e di tempi. Negli ultimi anni le tecnologie di sequenziamento Next Generation Sequencing, dette anche di terza generazione, si sono affiancate a quelle tradizionali, aprendo la possibilità di sequenziare contemporaneamente e, in tempi molto brevi, ingenti quantità di DNA3. Il nostro studio si è quindi proposto di testare questa tecnologia come una nuova, efficiente e conveniente strategia per definire il genotipo del paziente e accelerare la diagnosi. A tale scopo, abbiamo disegnato un sequencing array per analizzare tutti gli esoni e le sequenze fiancheggianti di 45 geni, causativi o potenzialmente implicati nella patogenesi della SNSR, che in seguito è stato utilizzato per il Targeted resequencing di una coorte di 15 pazienti pediatrici con diagnosi di SNSR sporadica e non sindromica. L'analisi bioinformatica dei dati prodotti dal sequenziamento ha identificato in 10, (67%) dei 15 soggetti analizzati, mutazioni causative o potenzialmente patogenetiche. In quattro pazienti abbiamo identificato mutazioni nel gene NPHS2, già descritte in letteratura come causative di SNSR4-7, in assetto omozigote o in assetto eterozigote composto. Nei rimanenti casi, abbiamo identificato varianti in assetto eterozigote in differenti geni, raramente associati a SNSR nei bambini, che abbiamo proposto come patogenetiche sulla base di analisi effettuate con programmi di predizione, analisi del grado di conservazione dei domini proteici tra le specie e dati di frequenza. In seguito, abbiamo ricercato correlazioni tra il genotipo del paziente e il fenotipo clinico, la risposta alla terapia farmacologica ed il quadro istopatologico della biopsia renale. L'analisi retrospettiva dei dati anamnestici ci suggerisce che è possibile stabilire una correlazione solo tra il genotipo e la risposta alla terapia. In pazienti affetti da SNSR una risposta negativa al nostro screening, tramite NGS predice in maniera robusta la risposta agli immunosoppressori, a prescindere dal quadro bioptico e ci impone un trattamento immediato con questi farmaci. In pazienti con anomalie genetiche è, invece, indicato un trattamento antiproteinurico con inibitori RAS, che devono essere possibilmente somministrati in combinazione ACE-Is e sartanici, alle più alte dosi tollerate dal paziente. Il test genetico con NGS risulta, quindi, uno strumento indispensabile per stabilire approcci terapeutici corretti (terapia immunosoprressiva, antiproteinurica) nei pazienti resistenti ai corticosteroidi e per l’identificazione di casi sfumati di sindromi complesse.