Development of new therapeutic strategies for hERG targeting in leukemia cells

Questa tesi si inserisce in un filone di ricerca in cui viene studiato il coinvolgimento di hERG, canale del potassio voltaggio dipendente nella patogenesi tumorale. In particolare è noto il suo ruolo nella chemioresistenza delle leucemie dipendente dal microambiente midollare e questo ha suggerito hERG come possibile bersaglio per la terapia antileucemica. In questo lavoro di tesi sono stati sviluppati due possibili approcci uno farmacologico e l’altro molecolare al fine di inibire l’attività di questo canale. Nel primo caso abbiamo scelto la claritromicina, un antibiotico macrolide già in commercio la cui attività inibitoria nei confronti di hERG è già stata documentata studiandone l’ effetto in combinazione o in assenza di citarabina (chemoterapico) su una linea cellulare di leucemia promielocitica acuta (HL60). Questi esperimenti sono stati effettuati su cellule in sospensione oppure in co-coltura con cellule stromali mesenchimali. Dagli esperimenti in vitro è stato dimostrato che la combinazione dei due farmaci riduce l’attività chemoprotettiva indotta dal microambiente midollare (CI=0.657). I risultati incoraggianti ci hanno permesso di passare a studiare l’effetto dei due farmaci su topi SCID (Severe Combined Immunodeficency Disease) inoculati con HL60 marcate con la luciferasi. Inizialmente è stata dimostrata la capacità della claritromicina di ridurre lo sviluppo tumorale e la sua invasività. Successivamente l’effetto combinato con citarabina garantisce una maggior sopravvivenza rispetto ai controlli, con almeno 20 giorni di differenza. Per quanto riguarda l’approccio molecolare abbiamo valutato la possibilità di silenziare hERG mettendo a punto nuovi sistemi per veicolare il siRNA corrispondente. Per questo scopo sono stati scelti quattro tensioattivi cationici: 12-3-12, 12-6-12, 12-12-12 e SH14 le cui micelle possono essere impiegate come vettori per la terapia genica. E’ stata studiata la cinetica di formazione dei complessi tra micelle e siRNA per conoscerne la struttura e quindi la stabilità, parametri chiave per l’efficienza di transfezione. La caratterizzazione chimico-fisica è stata seguita mediante SAXS presso European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) di Grenoble. Questa tecnica sfrutta l’utilizzo di un fascio di raggi X che, una volta diffuso dalla nuvola elettronica degli atomi specialmente da quelli con numero atomico più elevato che compongono i complessi, fornisce un segnale dipendente dalla struttura. E’ stato possibile misurare la variazione di forma e di dimensioni durante il processo di formazione dei complessi. Le due soluzioni di siRNA e di micelle sono state caricate separatamente mediante un dispositivo di miscelamento controllato via computer (stopped-flow) e accoppiato alla tecnica SAXS. Si è osservato che il processo di formazione dei complessi è estremamente rapido e avviene subito dopo il mixing, in tempi inferiori a 0.05s. All’interno dei nanoaggregati le due componenti (siRNA e micelle) si alternano con distanze ripetitive di 3-4nm e con l’aumentare del tempo il numero di unità che li compongono aumenta (fino a 4-8 unità a seconda del tipo di tensioattivo). Gli aggregati contenenti SH14 sono meno ordinati rispetto agli altri. Alla fine della registrazione (circa 15 minuti dopo il mixing) il raggio di girazione dei complessi è compreso tra 7 e 27nm; queste dimensioni sono compatibili con un’elevata efficienza di transfezione.