Caratterizzazione del topo uPAR knockout come possibile modello animale di sclerosi sistemica

Lo scopo della tesi è stato quello di ottenere un valido modello sperimentale di sclerosi sistemica (SSc), patologia caratterizzata da fibrosi della cute e degli organi interni e da microvasculopatia periferica. A tal fine è stata allestita e caratterizzata una colonia di topi knockout per il gene codificante il recettore dell'attivatore di tipo urochinasico del plasminogeno (uPAR o CD87). uPAR è infatti un componente chiave del sistema fibrinolitico ed è coinvolto in vari processi fisiopatologici, quali la trombolisi, il rimodellamento tissutale e l'angiogenesi. Il sistema fibrinolitico è costituito da un pro-enzima inattivo, il plasminogeno, che una volta convertito in plasmina degrada la fibrina e trasforma le pro-metalloproteasi di matrice (pro-MMP) in MMP attive, che a loro volta degradano i componenti della matrice extracellulare (ECM). Sono stati identificati due attivatori fisiologici del plasminogeno, uno tissutale (tPA) ed uno di tipo urochinasico (uPA o urochinasi), che si lega al proprio recettore uPAR. uPAR è un recettore di superficie, è costituto da tre domini extracellulari (D1-D2-D3), ed è espresso in diversi tipi cellulari, quali monociti, neutrofili, cellule T attivate, fibroblasti, cellule endoteliali e cellule muscolari lisce dei vasi. Studi recenti hanno dimostrato che le cellule endoteliali microvascolari ed i fibroblasti ottenuti dal derma di pazienti SSc presentano un recettore uPAR troncato (D2-D3) ed ipofunzionale che determina un severo deficit angiogenetico. E' stato inoltre recentemente provato che l’assenza di uPAR causa un’attivazione dei fibroblasti e che il suo clivaggio è una tappa cruciale nel differenziamento dei fibroblasti in miofibroblasti, i principali responsabili dell'eccessiva deposizione di collagene in corso di fibrosi. Un’alterata espressione di uPAR nelle cellule endoteliali e nei fibroblasti potrebbe pertanto essere coinvolta nei due principali aspetti della SSc: la microvasculopatia periferica, caratterizzata da un deficit angiogenetico e dalla perdita di capillari, ed il processo fibrotico. Per l'allestimento della colonia di topi da utilizzare negli esperimenti, topi maschi uPAR-/- sono stati incrociati, inizialmente, con femmine wild type, in modo tale da ottenere animali eterozigoti che, ulteriormente incrociati tra loro, hanno permesso di generare topi uPAR-/- ed uPAR+/+ con lo stesso background genetico ed appartenenti alla stessa colonia di allevamento. La presenza o l'assenza del gene uPAR attivo è stata determinata mediante PCR, eseguita sul DNA genomico estratto da biopsie prelevate dall'estremità della coda di ciascun animale. I topi sono stati allevati e al momento del sacrificio, a 12 e a 24 settimane di età, da essi sono stati prelevati i polmoni e biopsie di cute del dorso. Una parte dei campioni è stata processata per l'inclusione in paraffina e le successive analisi istopatologiche ed immunoistochimiche, mentre un’altra parte è stata processata per l’analisi del contenuto di collagene mediante il dosaggio dell’idrossiprolina. Le sezioni incluse in paraffina, tagliate al microtomo, sono state colorate con Ematossilina-Eosina, Tricromica di Masson e Rosso Sirio Picrato e sottoposte ad analisi immunoistochimica, sia in perossidasi che in fluorescenza. I risultati ottenuti permettono di proporre il topo uPAR-/- come un possibile nuovo modello murino di SSc. Nella cute degli animali uPAR-/- sono state infatti riscontrate gran parte delle caratteristiche patologiche della SSc umana: 1) lo spessore del derma, il contenuto di collagene ed il numero dei miofibroblasti sono risultati significativamente aumentati nei topi uPAR-/- rispetto ai controlli. Il derma dei topi uPAR-/- presenta inoltre fasci di collagene ispessiti, abbondante fibrosi perivascolare ed una parziale sostituzione del tessuto adiposo sottocutaneo da parte del tessuto connettivo fibroso; 2) nel derma dei topi uPAR-/- è risultata evidente una marcata sovraespressione delle citochine profibrotiche TGF-b, CTGF/CCN2 ed ET-1, notoriamente associate alla SSc umana; 3) nei topi uPAR-/- i cambiamenti fibrotici a carico della cute sono accompagnati da apoptosi delle cellule endoteliali e da una severa perdita del microcircolo; Il modello del topo uPAR-/- presenta caratteristiche patologiche simili a quelle riscontrate nella SSc umana anche a livello polmonare. Il pattern istopatologico osservato è infatti paragonabile a quello di una pneumopatia interstiziale aspecifica, con vaste aree di parenchima polmonare caratterizzate da infiammazione cellulare diffusa ed accumulo di collagene.