Il ruolo fondamentale dei canali TRP canali è sottolineato dalla loro ampia distribuzione nella maggior parte degli organi e tessuti (Clapham et al., 2003a). Il canale TRPA1, uno degli ultimi membri di questa famiglia ad essere stato scoperto (Jaquemar et al., 1999), presenta delle peculiari caratteristiche che lo rendono un interessante oggetto di studio. Il TRPA1, come i canali TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4 e TRPM8, è espresso nei neuroni sensitivi primari dei gangli delle radici dorsali, trigeminali, nodosi e vagali (Levine et al., 2007) che danno origine a fibre nervose afferenti che trasducono segnali sensoriali di varia natura (meccanica, chimica e termica). Sappiamo inoltre che il recettore TRPA1 risulta co-espresso con il TRPV1, il canale attivato dalla capsaicina, in una sottopopolazione di neuroni, per tale motivo definiti capsaicino-sensibili, che corrispondono ai nocicettori (Story et al., 2003) in quanto in grado di trasdurre a livello centrale stimoli di natura dolorosa. L'attivazione del canale TRPA1, espresso a livello neuronale, causa, tramite il rilascio di neuropeptidi proinfiammatori (SP e CGRP), dolore ed infiammazione neurogenica. Recentemente è stato ampiamente discusso come il recettore TRPA1 possa essere considerato un sensore di danno tissutale, in quanto esso viene attivato da numerose molecole endogene o esogene di natura irritante e mediatori infiammatori, generati anche dallo stress ossidativo (Trevisani et al., 2007; Andersson et al; 2008; Andrè et al., 2008; Materazzi et al., 2008; Taylor-Clark et al., 2009). Il ruolo di sensore dello stress ossidativo rende il TRPA1 un recettore rilevante per la patogenesi di patologie dell'apparato respiratorio, come asma o BPCO (Caceres et al., 2009). Dobbiamo anche ricordare che il TRPA1 è stato inizialmente clonato da fibroblasti polmonari fetali umani (Jaquemar et al., 1999). Studi recenti hanno evidenziato l’espressione del recettore TRPA1 in alcuni tipi cellulari non neuronali del tratto gastroenterico (Nozawa et al., 2009) e su cellule endoteliali vascolari (Earley et al., 2009) e, recentemente è stato anche localizzato nelle cellule della membrana basale dell'epidermide (Anand et al., 2008). Gli obiettivi della presente tesi sono stati diretti ad evidenziare e valutare ulteriormente l’espressione del canale TRPA1, identificato inizialmente a livello dei neuroni sensitivi primari, in vari organi e tessuti a livello non neuronale e identificarne coinvolgimento nelle varie patologie croniche infiammatorie e dolorose. Sulla base dei dati presenti in letteratura nei nostri studi abbiamo ipotizzato che il canale TRPA1 potesse essere espresso nel tessuto polmonare, anche a livello non neuronale, ed in particolare a livello delle cellule epiteliali delle vie aeree e dell'alveolo polmonare, che costituiscono un elemento fondamentale nei meccanismi che regolano varie patologie respiratorie. Questa ipotesi risulta suffragata dall’osservazione che nel polmone di ratto i livelli di mRNA per il canale TRPA1 risultano essere piuttosto elevati (Stokes et al., 2006). Inizialmente è stata valutata l’espressione del recettore TRPA1 in cellule epiteliali alveolari umane e, successivamente, ne è stata evidenziato il ruolo da un punto di vista funzionale. Pertanto, mediante le tecniche di Real-Time PCR ed immunocitochimica, abbiamo testato l’espressione del recettore TRPA1 in linee cellulari e colture primarie di cellule epiteliali umane residenti nelle vie aeree terminali (A549, SAEC) e nei fibroblasti fetali polmonari umani (IMR90). Successivamente, mediante esperimenti di calcium imaging abbiamo valutato la risposta funzionale di tali canali ad agonisti selettivi TRPA1, in presenza o meno di pretrattamento con antagonisti selettivi. Infine, ci siamo soffermati sull'aspetto fisiopatologico ed abbiamo preso in considerazione il danno cellulare (principalmente apoptosi) indotto dall'apertura del canale ed il conseguente ingresso massivo di ioni Ca2+. Inoltre, l'identificazione dell'espressione di canali ionici TRPA1 in vari distretti tissutali e tipi cellulari rappresenta un'area di ricerca di estremo interesse ed in rapido avanzamento, che sta mettendo in luce funzioni inattese di questo recettore pleiotropico, sia nella fisiologia che nella patologia d’organo rendendolo un ottimo possibile bersaglio in ambito terapeutico. Molti studi suggeriscono un ruolo chiave di alcuni membri della famiglia di canali ionici Transient Receptor Potential (TRP), tra cui il sottotipo anchirinico 1 (TRPA1) (Toxicol 2012;291:1) in modelli di dolore infiammatorio e neuropatico. Il canale TRPA1 è co-espresso con i sottotipi vanilloidi 1 e 4 (TRPV1 e TRPV4) in un sottogruppo di neuroni sensitivi primari peptidergici (nocicettori). Di fondamentale importanza per il presente progetto sono le osservazioni che il TRPA1, come sensore di stress ossidativo, in quanto attivato da specie reattive dell’ossigeno (ROS). Gli agenti chemioterapici che provocano CIPN sono in grado di aumentare lo stress ossidativo nell'uomo e negli animali da esperimento, e infine l’uso di antiossidanti produce beneficio in modelli di CIPN. Un altro filone della nostra ricerca è stato quello di analizzare il ruolo del canale TRPA1 nell’ipersensibilità meccanica e da freddo associata alla terapia con alcuni chemioterapici. Abbiamo studiato il contributo dei neuroni sensitivi primari, ed in particolare del recettore TRPA1, nel mediare gli effetti dolorosi associati alla terapia con chemioterapici. A tale scopo sono stati condotti studi di calcium imaging su colture primarie di neuroni sensitivi primari e su cellule trasfettate con il cDNA che codifica la proteina canale TRPA1 umana per valutare la capacità di paclitaxel e oxaliplatino di indurre mobilizzazione di Ca2+ intracellulare tramite attivazione del canale TRPA1. Sono stati inoltre allestiti modelli in vivo per stabilire il ruolo del recettore TRPA1 nel mediare gli effetti dolorosi associati al trattamento, locale e sistemico, con Paclitaxel e oxaliplatino. Quindi, tramite studi farmacologici, caratterizzati dall’impiego di antagonisti selettivi dei TRP, e studi genetici, eseguiti impiegando topi wild type e topi KO per il gene trpa1 (rispettivamente, Trpa1+/+ e Trpa1-/-) è stato possibile studiare il contributo del recettore TRPA1 espresso nei neuroni sensitivi primari negli stati dolorosi associati alla somministrazione dei due antitumorli.

Ruolo dei canali ionici nelle patologie infiammatorie dolorose / Pamela Pedretti. - (2014).

Ruolo dei canali ionici nelle patologie infiammatorie dolorose

PEDRETTI, PAMELA
2014

Abstract

Il ruolo fondamentale dei canali TRP canali è sottolineato dalla loro ampia distribuzione nella maggior parte degli organi e tessuti (Clapham et al., 2003a). Il canale TRPA1, uno degli ultimi membri di questa famiglia ad essere stato scoperto (Jaquemar et al., 1999), presenta delle peculiari caratteristiche che lo rendono un interessante oggetto di studio. Il TRPA1, come i canali TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4 e TRPM8, è espresso nei neuroni sensitivi primari dei gangli delle radici dorsali, trigeminali, nodosi e vagali (Levine et al., 2007) che danno origine a fibre nervose afferenti che trasducono segnali sensoriali di varia natura (meccanica, chimica e termica). Sappiamo inoltre che il recettore TRPA1 risulta co-espresso con il TRPV1, il canale attivato dalla capsaicina, in una sottopopolazione di neuroni, per tale motivo definiti capsaicino-sensibili, che corrispondono ai nocicettori (Story et al., 2003) in quanto in grado di trasdurre a livello centrale stimoli di natura dolorosa. L'attivazione del canale TRPA1, espresso a livello neuronale, causa, tramite il rilascio di neuropeptidi proinfiammatori (SP e CGRP), dolore ed infiammazione neurogenica. Recentemente è stato ampiamente discusso come il recettore TRPA1 possa essere considerato un sensore di danno tissutale, in quanto esso viene attivato da numerose molecole endogene o esogene di natura irritante e mediatori infiammatori, generati anche dallo stress ossidativo (Trevisani et al., 2007; Andersson et al; 2008; Andrè et al., 2008; Materazzi et al., 2008; Taylor-Clark et al., 2009). Il ruolo di sensore dello stress ossidativo rende il TRPA1 un recettore rilevante per la patogenesi di patologie dell'apparato respiratorio, come asma o BPCO (Caceres et al., 2009). Dobbiamo anche ricordare che il TRPA1 è stato inizialmente clonato da fibroblasti polmonari fetali umani (Jaquemar et al., 1999). Studi recenti hanno evidenziato l’espressione del recettore TRPA1 in alcuni tipi cellulari non neuronali del tratto gastroenterico (Nozawa et al., 2009) e su cellule endoteliali vascolari (Earley et al., 2009) e, recentemente è stato anche localizzato nelle cellule della membrana basale dell'epidermide (Anand et al., 2008). Gli obiettivi della presente tesi sono stati diretti ad evidenziare e valutare ulteriormente l’espressione del canale TRPA1, identificato inizialmente a livello dei neuroni sensitivi primari, in vari organi e tessuti a livello non neuronale e identificarne coinvolgimento nelle varie patologie croniche infiammatorie e dolorose. Sulla base dei dati presenti in letteratura nei nostri studi abbiamo ipotizzato che il canale TRPA1 potesse essere espresso nel tessuto polmonare, anche a livello non neuronale, ed in particolare a livello delle cellule epiteliali delle vie aeree e dell'alveolo polmonare, che costituiscono un elemento fondamentale nei meccanismi che regolano varie patologie respiratorie. Questa ipotesi risulta suffragata dall’osservazione che nel polmone di ratto i livelli di mRNA per il canale TRPA1 risultano essere piuttosto elevati (Stokes et al., 2006). Inizialmente è stata valutata l’espressione del recettore TRPA1 in cellule epiteliali alveolari umane e, successivamente, ne è stata evidenziato il ruolo da un punto di vista funzionale. Pertanto, mediante le tecniche di Real-Time PCR ed immunocitochimica, abbiamo testato l’espressione del recettore TRPA1 in linee cellulari e colture primarie di cellule epiteliali umane residenti nelle vie aeree terminali (A549, SAEC) e nei fibroblasti fetali polmonari umani (IMR90). Successivamente, mediante esperimenti di calcium imaging abbiamo valutato la risposta funzionale di tali canali ad agonisti selettivi TRPA1, in presenza o meno di pretrattamento con antagonisti selettivi. Infine, ci siamo soffermati sull'aspetto fisiopatologico ed abbiamo preso in considerazione il danno cellulare (principalmente apoptosi) indotto dall'apertura del canale ed il conseguente ingresso massivo di ioni Ca2+. Inoltre, l'identificazione dell'espressione di canali ionici TRPA1 in vari distretti tissutali e tipi cellulari rappresenta un'area di ricerca di estremo interesse ed in rapido avanzamento, che sta mettendo in luce funzioni inattese di questo recettore pleiotropico, sia nella fisiologia che nella patologia d’organo rendendolo un ottimo possibile bersaglio in ambito terapeutico. Molti studi suggeriscono un ruolo chiave di alcuni membri della famiglia di canali ionici Transient Receptor Potential (TRP), tra cui il sottotipo anchirinico 1 (TRPA1) (Toxicol 2012;291:1) in modelli di dolore infiammatorio e neuropatico. Il canale TRPA1 è co-espresso con i sottotipi vanilloidi 1 e 4 (TRPV1 e TRPV4) in un sottogruppo di neuroni sensitivi primari peptidergici (nocicettori). Di fondamentale importanza per il presente progetto sono le osservazioni che il TRPA1, come sensore di stress ossidativo, in quanto attivato da specie reattive dell’ossigeno (ROS). Gli agenti chemioterapici che provocano CIPN sono in grado di aumentare lo stress ossidativo nell'uomo e negli animali da esperimento, e infine l’uso di antiossidanti produce beneficio in modelli di CIPN. Un altro filone della nostra ricerca è stato quello di analizzare il ruolo del canale TRPA1 nell’ipersensibilità meccanica e da freddo associata alla terapia con alcuni chemioterapici. Abbiamo studiato il contributo dei neuroni sensitivi primari, ed in particolare del recettore TRPA1, nel mediare gli effetti dolorosi associati alla terapia con chemioterapici. A tale scopo sono stati condotti studi di calcium imaging su colture primarie di neuroni sensitivi primari e su cellule trasfettate con il cDNA che codifica la proteina canale TRPA1 umana per valutare la capacità di paclitaxel e oxaliplatino di indurre mobilizzazione di Ca2+ intracellulare tramite attivazione del canale TRPA1. Sono stati inoltre allestiti modelli in vivo per stabilire il ruolo del recettore TRPA1 nel mediare gli effetti dolorosi associati al trattamento, locale e sistemico, con Paclitaxel e oxaliplatino. Quindi, tramite studi farmacologici, caratterizzati dall’impiego di antagonisti selettivi dei TRP, e studi genetici, eseguiti impiegando topi wild type e topi KO per il gene trpa1 (rispettivamente, Trpa1+/+ e Trpa1-/-) è stato possibile studiare il contributo del recettore TRPA1 espresso nei neuroni sensitivi primari negli stati dolorosi associati alla somministrazione dei due antitumorli.
2014
Pierangelo Geppetti
ITALIA
Pamela Pedretti
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