DEVELOPMENT AND CHARACTERIZATION OF GREEN LIPID-BASED NANOVECTORS FOR AGRICULTURAL APPLICATIONS SVILUPPO E CARATTERIZZAZIONE DI NANOVETTORI LIPIDICI “VERDI” PER APPLICAZIONI AGRONOMICHE

Nanotechnologies include a wide range of devices of nanometer scale size, which find application in many different fields, such as medicine, aerospace and energy production, to name but a few. Among these, lipid-based nanoparticles have been the longest-studied nanocarriers since they are the least toxic for in vivo applications. The use of nanotechnology in agriculture is relatively new, especially dealing with plant protection and production. Since a transition from an intensive farming based on the massive use of pesticides and conventional phytochemicals, towards a more sustainable one is by now mandatory, the development of alternative formulations has been investigated in this work. Specifically, two natural matrixes were used as source of physiological lipids for the fabrication of nanoparticles, which were loaded with plant-derived compounds. The design, the structural characterization and finally, the testing of these nanovectors, are presented and discussed in the first and second section of this thesis. Moreover, a formulation of co-crystals mainly composed of natural constituents was provided by the Department of Chemistry, Life Sciences and Environmental Sustainability of the University of Parma and tested as antimicrobial. Results of this experimentation are shown in the last section of the thesis. In the first section, a specifically designed methodology for phytohormones’ application on olive cuttings is presented and experimented. Olive pomace was used as lipid source for the development of nanocarriers delivering auxins as root-promoting phytohormones. Auxins are poorly soluble in water, thus lipid nanovectors were fabricated as carriers for their delivering to the roots, to improve their plant availability. In addition, the biocompatibility of these devices was improved choosing olive pomace as raw material for the manufacturing, and olive cuttings as final target of the experimentation, originating a green circle starting from olive waste and ending with olive plant itself. The second part of this thesis deals with the development of lipid-based nanocarriers derived from the microalga Nannochloropsis sp. Similarly to auxins’ carrier-mediated transport, the obtained nanodevices were used to overcome the poor water solubility of the bioactive molecule to be delivered, thymol, and also to reduce its volatilization. This terpenoid belongs to a large family of plant-derived compounds which have received remarkable attention because of the peculiar characteristics displayed as antimicrobial, antifungal, insecticidal and antioxidant natural agents. An evaluation of the antibacterial activity of the thymol-delivering nanovectors was carried out against a gram-negative bacterium affecting tomato and pepper plants. Finally, the third section is dedicated to a project in collaboration with the Department of Chemistry, Life Sciences and Environmental Sustainability of the University of Parma, where a powdery formulation of co-crystals specifically designed for the delivery of terpenoids was developed. A set of six co-crystals was synthesized matching thymol, eugenol and carvacrol with hexamethylenetetramine and phenazine in a specific stoichiometric ratio. The release profile of the bioactive molecules from the co-crystals was determined and the antibacterial and fungicidal activity displayed by this formulation was studied in vitro against six bacterial and three fungi species. Despite the different composition, state of matter and final purpose of use, all the systems studied during this PhD were specifically designed to favor the association with the compounds to be loaded, in order to overcome the poor water solubility displayed by auxins and terpenoids. The molecules selected for the delivery were all plant-derived and the composition of the three formulations was primarily based on the use of natural constituents extracted, purified or recovered by biological matrixes, being one of the prime intents that of proposing a biocompatible and low-toxic alternative to the conventional phytochemicals. L’impiego di ingenti quantitativi di antiparassitari, diserbanti ed altri prodotti chimici di sintesi, ha fortemente compromesso la qualità dei raccolti e la produttività dei terreni agricoli, con serie ripercussioni sull’ambiente, sulla salute dell’uomo e degli animali. In Europa una maggior sensibilità dell’opinione pubblica verso queste tematiche e l’urgenza di trovare valide alternative ai metodi più comunemente utilizzati, hanno richiamato l’attenzione di molti dei paesi membri, che da alcuni anni stanno proponendo politiche ambientali più sostenibili. In questo contesto, le nanotecnologie rappresentano uno strumento di supporto utile allo sviluppo di nuove strategie e metodologie di trattamento in ambito agronomico. Nella presente tesi di dottorato sono state affrontate due problematiche di interesse primario per questo settore, vale a dire produttività e impiego di antiparassitari. A tal fine sono stati realizzati dei nanovettori lipidici utilizzando biorisorse naturali, con l’obiettivo ultimo di promuovere l’efficacia delle molecole veicolate dal nanosistema stesso. La scelta di utilizzare questo tipo di nanotecnologia nasce dai numerosi vantaggi d’impiego dei nanovettori a base lipidica, la cui composizione li rende particolarmente biocompatibili e biodegradabili. Nel primo caso è stato ideato e sviluppato un formulato per il trasporto di auxine derivato da uno scarto del processo di spremitura delle olive, la sansa di oliva. Le auxine sono ormoni vegetali comunemente utilizzati in floricoltura e nella riproduzione per talea per promuovere lo sviluppo e l’accrescimento della pianta. La scarsa idrosolubilità di questi composti, tuttavia, ne limita la biodisponibilità e, di conseguenza, l’efficacia di azione. Questo inconveniente è stato aggirato caricando le auxine nei nanovettori lipidici ottenuti da sansa di oliva, la cui struttura è stata caratterizzata tramite tecniche di Dynamic Light Scattering, potenziale zeta e Small-angle X-ray Scattering, e la cui efficacia è stata infine testata su talee di olivo appartenenti a tre differenti cultivar. I risultati ottenuti hanno mostrato un aumento della percentuale di radicazione rispetto ai trattamenti convenzionali in due delle tre cultivar selezionate. Nel secondo caso Nannochloropsis sp., una microalga marina principalmente costituita di lipidi, è stata scelta come biorisorsa per la realizzazione di nanovettori caricati con timolo. Questo terpenoide si ritrova nella miscela aromatica di numerose specie vegetali ed è un potente antibatterico e fungicida naturale. La sua natura volatile, però, ne pregiudica l’efficacia a lungo termine, limitandone fortemente le potenzialità. Il carattere idrofobico del timolo è stato sfruttato per favorirne l’associazione con i nanovettori lipidici ottenuti da alga che, fungendo da veri e propri siti di accumulo, sono stati sperimentati come agenti di trasporto dell’antibatterico in esperimenti in vitro condotti contro un batterio patogeno della pianta di pomodoro. I risultati di questi test hanno mostrato una completa inibizione della crescita batterica in presenza di nanovettori carichi di timolo per concentrazioni pari o superiori a 250 ppm. Struttura e dimensioni dei nanovettori sono state determinate tramite le tecniche sopracitate e il timolo caricato al loro interno è stato quantificato mediante gas-cromatografia accoppiata a spettrometria di massa. Infine, l’utilizzo di timolo, carvacrolo ed eugenolo come antimicrobici naturali, è stato ulteriormente indagato sperimentando l’efficacia di una formulazione solida, alternativa ai nanovettori lipidici in solvente acquoso. Questi tre terpenoidi sono stati scelti per lo sviluppo di sei co-cristalli, combinando ciascuno di essi con fenazina o esametilentetrammina (coformeri) secondo un preciso rapporto stechiometrico; in tal modo sono stati ottenuti dei formulati di natura polverulenta, la cui bioattività è stata saggiata in vitro contro sei specie batteriche e tre fungine fitopatogene o benefiche per le piante. I risultati ottenuti hanno mostrato come l’efficacia dei monoterpeni venga in alcuni casi potenziata dalla combinazione con il coformero, poiché a parità di concentrazione, alcuni co-cristalli mostrano un’azione biocida significativamente superiore a quella dei corrispondenti costituenti puri. In conclusione, in questa tesi vengono presentate tre formulazioni a base di composti derivati dalle piante, di cui due in solvente acquoso e una allo stato solido; la loro efficacia è stata studiata tramite test di laboratorio con l’intento finale di ideare e realizzare prodotti alternativi ai fitofarmaci tradizionali per possibili impieghi in agricoltura.